高速逆流色谱分离制备高纯度DHA方法技术

本发明专利技术公开了高速逆流色谱分离制备高纯度DHA方法。本发明专利技术提供了一种提取DHA的方法，包括如下步骤：1）将微藻油在氢氧化钾–甲醇溶液中进行皂化处理，得到皂化处理后溶液；2）将所述皂化处理后溶液进行高速逆流色谱分离，得到二十二碳六烯酸；所述微藻油为从微藻细胞中提取的油脂。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术首次利用高速逆流色谱技术从微藻油中分离纯化得到高纯度的DHA，其工艺更加简单、操作方便、样品无损失、高效快速、制备量大及纯度高，是一种适合大量制备生产高纯度不饱和脂肪酸的良好方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术生物
，尤其涉及一种高速逆流色谱分离制备高纯度DHA方法。
技术介绍
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)在改善人脑记忆、治疗心血管疾病、防治老年痴呆以及抗肿瘤等方面有着重要的生理调节功能，在疾病预防及治疗方面已经引起了人们的广泛关注。目前，DHA的主要商业来源为深海鱼油，由于渔业资源的日益枯竭，加之鱼油产品提纯工艺复杂且具有难以去除的鱼腥味等，使得人们渐渐把目光转向新的DHA资源。微生物发酵生产DHA以其独特的优势而成为国内外研究的热点之一，其中利用微藻培养生产DHA具有更大的优势和生产潜能。微藻具有生长周期短，繁殖速度快，可塑性强，对营养要素要求简单等特点，而且部分可以通过生物工程方法和培养条件的控制达到高密度发酵培养。目前已发现多种微藻中富含多不饱和脂肪酸(PUFAs)，如裂壶藻、隐甲藻等。微藻是海洋食物链中多不饱和脂肪酸的最初生产者，有些藻细胞中多饱和脂肪酸DHA、EPA含量较高，其相对含量高达细胞干重的5%飞％，而且所含的多不饱和脂肪酸种类比较单纯，进行单一成分的分离提纯相对容易一些，因而利用海洋微藻生产多不饱和脂肪酸是一个非常有前景的商业领域。微藻油因多富含多不饱和脂肪酸，已被广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料等领域。随着对海洋生物脂肪酸研究的深入以及各种层析、色谱技术的出现，人们研究了众多从生物体中提取DHA的方法，主要有:溶剂萃取法、低温结晶法、尿素包合法、吸附分离法、分子蒸馏法、脂肪酶浓缩法、超临界CO2提取法、高效液相色谱法、金属盐形成法等。为了进一步提高DHA的浓度，一般是将几种方法结合起来使用。目前有望在实际中得以应用的，相对比较完整、经济的提取工艺是A.Robles Medina和Cartens M等提出的三步法，即首先利用直接皂化法从细胞中提取脂肪酸组分，然后用尿素结晶法对PUFA进行浓缩，最后利用高压液相色谱进行EPA和DHA的分离纯化。高速逆流色谱(high-speedcountercurrent chromatography, HSCCC)是由美国国立卫生研究院的YoichiiO Ito博士于上世纪80年代专利技术的一种基于液液分配机理的新型色谱分离纯化技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。经过几十年的实验研究，特别是近十多年高速逆流色谱的发展，使得它在生物工程、医药、生化、植化、农业、化工、环境、海洋科学、无机化学等广泛领域显现出越来越高的实用价值。目前国际上有数十个国家及地区的著名研究机构和大学在从事逆流色谱技术的研究及在各个领域的应用工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提取二十二碳六烯酸的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤:I)将微藻油进行皂化处理，得到皂化处理后溶液； 2)将所述皂化处理后溶液进行高速逆流色谱分离，得到二十二碳六烯酸(DHA)；所述微藻油为从微藻细胞中提取的油脂。其中，所述氢氧化钾-甲醇溶液的溶质为氢氧化钾，溶剂为甲醇。在本专利技术的实施例中，所述微藻油为从微藻细胞中采用标准索氏抽提法(GB5009.6-85)提取的油脂。上述方法中，步骤2 )中，所述高速逆流色谱采用的溶剂为正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇混合液；所述正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇混合液为将正庚烷、乙腈、乙酸和甲醇按照体积比为4:5:1:1混合得到；所述高速逆流色谱的转速为850-900rpm ；所述高速逆流色谱的溶剂的流速为2-3mL/min ；所述高速逆流色谱的溶剂的下相为流动相，溶剂的上相为固定相。步骤2)中，所述高速逆流色谱(HSCCC)采用蒸发光检测器进行检测，其中漂移管温度50-65°C，漂移管温度具体为55°C ;气体流量为1.5-2.5L/min，气体流量具体为2.5L/mirio上述方法中，步骤I)中,所述皂化处理为将微藻油在氢氧化钾-甲醇溶液中进行皂化处理，具体按照包括如下步骤的方法进行:A、将所述微藻油与所述氢氧化钾-甲醇溶液混合后，调pH值为酸性，得到酸性混合液；B、用乙醚萃取所述酸性混合液，收集乙醚相；C、去除所述乙醚相中的乙醚，再溶解，得到皂化处理后溶液；步骤2)中，所述高速逆流色谱的转速为900rpm ；所述高速逆流色谱的溶剂的流速为3mL/min。上述方法中，步骤A中，所述氢氧化钾-甲醇溶液的浓度为0.4-0.6mol/L ；所述微藻油和所述氢氧化钾-甲醇溶液的配比为(18-22) mg:1ml ；所述混合为在65-75°C水浴下混合l_2h ；所述调pH值采用浓度(体积百分含量)为20%的硫酸水溶液，所述调pH值为酸性为调pH值为1-3 ；步骤B中，所述用乙醚萃取所述酸性混合液为将所述酸性混合液和所述乙醚等体积混匀萃取；步骤C中，所述去除所述乙醚相中的乙醚采用旋转蒸发去除；所述溶解所需的溶剂为所述正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇混合液静置后的下相。上述方法中，步骤A中，所述氢氧化钾-甲醇溶液的浓度为0.5mol/L ;所述微藻油和所述氢氧化钾-甲醇溶液的配比为20mg:1ml ；所述混合为在70°C水浴下混合1.5h ；步骤B中，所述萃取的次数为3次。上述方法中，所述微藻为裂壶藻Schizochytrium sp.;所述裂壶藻Schizochytrium sp.具体为裂壶藻 Schizochytrium sp.T101101CGMCC N0.4603。高速逆流色谱在从微藻中提取DHA中的应用也是本专利技术保护的范围；在上述应用中，所述微藻具体为裂壶藻Schizochytrium sp.;所述裂壶藻Schizochytrium sp.进一步具体为裂壶藻 Schizochytrium sp.T101101CGMCC N0.4603。本专利技术的实验证明，本专利技术首次利用高速逆流色谱技术从微藻油中分离纯化得到高纯度的DHA，其工艺更加简单、操作方便、样品无损失、高效快速、制备量大及纯度高，是一种适合大量制备生产高纯度不饱和脂肪酸的良好方法。附图说明图1为利用高速逆流色谱仪分离DHA的色谱2为分离获得的DHA样品的HPLC分析具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、DHA的获得一、提取1、微藻油的提取裂壶藻Schizochytrium sp.T101101,保藏在中国微生物菌种保藏中心，CGMCCN0.4603。裂壶藻Schizochytrium sp.T101101已于2011年02月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.4603，建议的分类命名为Schizochytrium sp.。I)发酵将裂壶藻Schizochytrium sp.T101101在培养基及培养条件为:葡萄糖130g,酵母浸膏30g，蛋白胨20g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁3g，0.5X海水(用淡水稀释I倍的海水)定容至1L，温度30°C，pH值7.5，转速500rpm，培养时间96h的条件下进行发酵培养，得到裂壶藻 Schizochytrium sp.T101101 发酵液。将发酵液在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤：1）将微藻油进行皂化处理，得到皂化处理后溶液；2）将所述皂化处理后溶液进行高速逆流色谱分离，得到二十二碳六烯酸；所述微藻油为从微藻细胞中提取的油脂。

【技术特征摘要】
1.一种提取二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤: 1)将微藻油进行皂化处理，得到皂化处理后溶液； 2)将所述皂化处理后溶液进行高速逆流色谱分离，得到二十二碳六烯酸； 所述微藻油为从微藻细胞中提取的油脂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 步骤2)中，所述高速逆流色谱采用的溶剂为正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇混合液；所述正庚烷-乙腈-乙酸-甲醇混合液为将正庚烷、乙腈、乙酸和甲醇按照体积比为4:5:1:1混合得到； 所述高速逆流色谱的转速为850-900rpm ;所述高速逆流色谱的溶剂的流速为2_3mL/min ； 所述高速逆流色谱的溶剂的下相为流动相，溶剂的上相为固定相。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于: 步骤I)中，所述皂化处理为将微藻油在氢氧化钾-甲醇溶液中进行皂化处理，具体按照包括如下步骤的方法进行: A、将所述微藻油与所述氢氧化钾-甲醇溶液混合后，调pH值为酸性，得到酸性混合 液； B、用乙醚萃取所述酸性混合液，收集乙醚相； C、去除所述乙醚相中的乙醚，再溶解，得到皂化处理后溶液； 步骤2)中，所述高速逆流色谱的转速为900rpm ； 所述高速逆流色谱的溶剂的流速为3mL/min。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于: 步骤A中，所述氢氧化钾-甲醇溶液的浓度为0.4-0.6mol/L ； 所述微藻油...

【专利技术属性】
技术研发人员：林祥志，荣辉，马瑞娟，林汝榕，杨善军，王昭凯，马勇，陈水波，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：