突变的A2M基因5端侧翼区和3端非翻译区及其检测引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种突变的A2M基因5端侧翼区，序列如SEQ ID NO.8所示。一种突变的A2M基因3端非翻译区，序列如SEQ ID NO.7所示。经实验证明，上述突变的A2M基因5端侧翼区作为启动子具有更强的启动活性，突变的A2M基因3端非翻译区能够影响miR-2898的结合能力，突变后3端非翻译区靶序列和miR-2898的结合能力比突变前减弱，因此，这两种突变可以在奶牛育种改良过程中作为候选基因的功能性分子标记，用于辅助选择具有更高乳腺炎抗性的个体，通过分子标记辅助选育乳腺炎抗性个体，从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系。本发明专利技术还提供了检测该突变的引物、试剂盒和检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种突变的A2M基因5端侧翼区和3端非翻译区，及其检测引物、试剂盒和检测方法，以及在奶牛遗传改良中的应用。
技术介绍
奶牛乳腺炎是发生在乳腺组织的一种炎症反应，是奶牛饲养中最常见和最复杂的疾病，也是造成奶牛业损失最大的一种疾病(Seegers等，2003)。引起奶牛乳腺炎发生的主要原因是环境中的病原菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等。目前，奶牛乳腺炎的防治与预防措施主要是通过奶牛生产中抗生素的使用，但抗生素的应用会带来许多负面的影响，如病原菌耐药性升高、乳品质降低，并且没有从根本上消除奶牛乳腺炎的发病率。基因的单核苷酸突变对于基因的表达调控和功能活性有重要的作用，对个体的表型有重要的作用。若通过分子育种手段对奶牛乳腺炎抗性候选基因的分子标记进行选择，同时对其进行功能性验证，最终选择功能性的位点进行奶牛遗传育种，可改善奶牛抗乳腺炎能力，降低药物的使用量，提高牛奶质量，减少经济损失。a 2巨球蛋白(Alpha-2-macroglobulin, A2M)是在先天性免疫反应中的一员(Armstrong等，1999),它和C3、C4和C5 —起同属于a -巨球蛋白家族的成员(Levashina等，2001)。A2M是哺乳动物中的一种广谱蛋白酶抑制剂，参与宿主防御机制，通过抑制侵入机体的寄生虫和病原体释放的多种蛋白酶与毒素，减少其对宿主的破坏，增强宿主的抗病力(Enghild 等，1989 ；Armstrong, 2006)。单核苷酸突变可引起基因产物表达量或功能的改变，这在基因控制的表型多样性上有重要的作用(Gruber等，2012)。基因5端启动子区和3端非翻译区都可调节基因的表达，其中5端启动子区域内的单核苷酸突变，可影响基因的转录活性；而3端非翻译区的碱基突变可通过改变miRNA的结合能力从而影响基因的翻译表达。单核苷酸突变是哺乳动物基因组最常见的变异类型，有报道它与包含奶牛乳腺炎症在内的很多疾病有关(Nicoloso, 2010 ;Poletto，2012)。但是到目前为止，未有研究报道牛A2M基因的启动子区和3端非翻译区内存在和奶牛乳腺炎有关的功能性SNPs。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种影响奶牛乳腺炎抗性的突变的A2M基因5端侧翼区和3端非翻译区， 该突变可以作为奶牛乳腺炎抗性候选基因在筛选和鉴定奶牛是否具有乳腺炎抗性中进行应用，本专利技术还提供了检测该突变的引物、试剂盒和检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种突变的A2M基因5端侧翼区，序列如SEQ ID N0.8所示，与野生型A2M基因5端侧翼区相比，其SNPs位点如下:g.-724A>G (对应SEQ ID N0.8所示的序列中，相当于第1918位碱基A>G)，g.-665G>A (对应SEQ ID N0.8所示的序列中，相当于第1977位碱基为A)，g.-535C>G (对应SEQ ID N0.8所示的序列中，相当于第2107位碱基为C>G)和g.-520_-519insA (对应SEQ ID N0.8所示的序列中，相当于第2122和2124位之间插入一个A)，这4个SNPs位点完全连锁。一种突变的A2M基因3端非翻译区，序列如SEQ ID N0.7所示，与野生型A2M基因3端非翻译区相比，其SNP位点如下:c.4659_4661delC (对应SEQ ID N0.7所示的序列中，相当于第501和502位之间删除一个C)，该SNP位点与权利要求1所述的5端侧翼区的4个SNPs位点关联。上述突变的A2M基因5端侧翼区和3端非翻译区作为奶牛乳腺炎抗性候选基因在筛选和鉴定奶牛是否具有乳腺炎抗性中的应用。经实验证明，上述突变的A2M基因5端侧翼区作为启动子具有更强的启动活性，突变的A2M基因3端非翻译区能够影响miR-2898的结合能力，突变后3端非翻译区靶序列和miR-2898的结合能力比突变前减弱，因此，这两种突变可以在奶牛育种改良过程中作为候选基因的功能性分子标记，用于辅助选择具有更高乳腺炎抗性的个体，通过分子标记辅助选育乳腺炎抗性个体，从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系。具体筛选方式可以如下:通过生物学相关技术检测个体奶牛A2M基因这些位点的基因型，并且通过和奶牛乳中体细胞评分的关联分析，选择乳腺炎抗性有利的基因型个体留种，用于辅助选择具有更高乳腺炎抗性的个体从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系，可以提高候选A2M抗性基因型在奶牛群体中的频率，从而提高群体奶牛抗乳腺炎的能力，降低奶牛乳腺炎的发病率，减少奶牛业的经济损失。一种A2M基因5端侧翼区的引物，上游弓I物的序列如SEQ ID N0.1,下游引物的序列如 SEQ ID N0.2。一种检测A2M基因3端非翻译区的引物，上游引物的序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.6所示。经实验证明，A2M基因5端侧翼区的四个SNPs位点完全连锁，3端非翻译区的SNP位点与5端侧翼区的4个SNPs位点关联性较高，因此，在检测奶牛个体中是否存在上述突变时，只检测其中一个SNP位点即可，从检测成本及可行性、方便性等方面考虑，本专利技术选用检测3端非翻译区的SNP位点作为判断标准，并给出了专用的检测试剂盒及检测方法。一种A2M基因3端非翻译区的试剂盒，包括:上、下游引物，IOii mol/L ；2XTaqPCRMasterMix ；10XFastDigest 酶切缓冲液；FastDigest 限制性内切酶 ScrFI ;双蒸水；2000bp DNALadder Marker ;其中，上游引物的序列如SEQ ID N0.5所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.6所示，该引物能够扩增出序列如SEQ ID N0.7所示的片段；2XTaq PCRMasterMix 是由 MgCl2 (4mM)> dNTPs (0.4mM) > Taq DNA Polymerase (0.05units/ U I)组成的。一种筛选或鉴定奶牛是否具有乳腺炎抗性的方法:利用SEQ ID N0.5和SEQ IDN0.6所示的引物对对待检测奶牛的A2M基因3端非翻译区进行扩增，得到的DNA扩增片段用ScrFI酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳检测:若得到502bp和379bp两条带，则证明该待检测奶牛的A2M基因3端非翻译区为野生型；若得到881bp —条带，则证明该待检测奶牛的A2M基因3端非翻译区为突变型； 若得到881bp、502bp和379bp三条带，则证明该待检测奶牛的A2M基因3端非翻译区为杂合型；突变型和杂合型的奶牛具有乳腺炎抗性。上述所述引物的合成由北京华大基因公司完成，快速鉴定酶由Fermentas公司提供。本专利技术提供了一种鉴定奶牛抗乳腺炎候选基因功能性分子标记的方法。利用在线启动子预测软件分析了牛A2M基因5端侧翼区可能存在的启动子区域，同时测序鉴定5端侧翼区存在的单核苷酸多态性位点，利用序列递减方法构建含不同片段长度及不同基因型的启动子载体，进行细胞转染实验鉴定了 A2M基因启动子区及含不同基因型片段的启动子活性强弱；也测序发现A2M基因3端非翻译区存在的SNP位点，软件分析并结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种突变的A2M基因5端侧翼区，其特征在于：序列如SEQ ID NO.8所示，与野生型A2M基因5端侧翼区相比，其单核苷酸多态位点如下：g.‑724A>G，g.‑665G>A，g.‑535C>G和g.‑520_‑519insA，这4个SNPs位点完全连锁。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金明，王秀革，鞠志花，袁金铎，仲跻峰，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37