本发明专利技术公开了一种可以调控人参皂苷积累的PDR转运蛋白基因启动子及其应用，该启动子ProPDR1的DNA序列如SEQIDNo.1所示，或是与SEQIDNo.1具有99%以上同源性的DNA序列。本发明专利技术采用基因组步移技术(Genomewalker)克隆得到PgPDR1转运蛋白基因启动子序列，该序列包含TCA元件和TCCACCT-Motif。本发明专利技术构建启动子表达载体pBI121-ProPDR1::GUS，在启动子ProPDR1的驱动下，报告基因GUS在转基因烟草中可较强地受人参皂苷、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸的调控，表明该启动子启动的人参PgPDR1基因表达与人参皂苷的积累密切相关。因此，本发明专利技术提供的启动子，在药用植物次生代谢产物的合成与积累调控的基因工程中具有十分重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一个可以调控人参皂苷积累的TOR转运蛋白基因的启动子。
技术介绍
人参0°.ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,是名贵中药材。人参中含有多种药用成分，其中人参皂苷是人参最主要的活性成分。目前已从人参根中分离出50余种人参皂苷，现代医学研究证明各皂苷单体具有重要的药用价值，且已广泛应用于临床。但是其中一些具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等活性强的皂苷含量极低。利用人参皂苷合成代谢相关的基因调控技术促进人参皂苷的合成与积累具有重要的理论价值和应用前景。基因的有效转录和表达是发挥其基因功能的重要条件，基因成功转录和表达需要依靠启动子对其的调控，启动子与RNA聚合酶、转录调控因子等相互作用发挥其调控的功能。真核生物中的TATA和CAAT框，它们决定了转录的起始位点和效率，负责和RNA聚合酶结合，启动基本转录过程。启动子组件有许多不同的类型，包括病原诱导型作用元件、组织特异型作用元件和化学诱导作用元件等。其中化学物质诱导型作用元件在促进次生代谢产物合成方面起重要作用。在次生代谢产物合成与积累相关基因的表达过程中，顺式作用元件通过与转录因子的相互作用发挥着重要调控作用:环境刺激经过一系列信号转导、传递后，激活防卫相关转录因子与特异顺式作用元件的相互作用，从而实现相关防卫功能基因的表达。鉴于顺式作用元件的上述重要调控作用，使用诱导型启动子介导的抗性基因无疑具有多方面的优势，因此鉴定次生代谢产物合成与积累相关的诱导型启动子已成为目前植物分子生物学研究的热点之一。在人参`次`生代谢调控中，可以通过导入关键酶等基因调控合成途径中的多步限速反应，或者通过顺式作用元件在转录水平调控人参皂苷合成、转运和积累相关基因的表达，从而提闻人参阜昔的含量。植物ABC (ATP-binding cassette transporter)转运蛋白是目前已知最大，功能最广泛的蛋白家族，ABC转运蛋白属跨膜运输蛋白，利用水解ATP释放的能量转运有机酸、生物碱、细胞代谢产物和药物等。参与细菌耐药性、次生代谢产物积累、胁迫反应和肿瘤抗药性等。ABC转运蛋白家族包括多向耐药性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多药耐药性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亚族,是植物和真菌中特有的一种ABC转运蛋白。但目前对植物PDR基因相关研究甚少，离体细胞培养中，香紫苏醇可诱导層基因上调表达，在细胞内NpTORl蛋白累积增强了细胞向胞外转运香紫苏醇以及其类似物的能力。拟南芥(A细胞内香紫苏醇的累积亦能诱导基因上调表达，同时在细胞外检测到AtH)R12蛋白向胞外转运的香紫苏醇，推测萜类物质可能是基因表达的上游调控物质。矮牵牛中PhTORl蛋白可以转运一种新发现的植物激素-独角金内酯，进而促进矮牵牛分枝。因而，PDR转运蛋白基因在调控次生代谢产物的积累方面具有重要的潜力。然而，在人参中尚无PDR蛋白基因及其调控元件的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在从人参中分离出受人参皂苷等化学物质诱导调控的诱导型启动子，从而提供一种能够调控人参皂苷转运与积累相关的基因资源，为今后开发基因工程产品奠定基础。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种调控人参皂苷转运与积累的基因的启动子ProPDRl，其序列如SEQ ID N0.1所示。本专利技术的启动子ProPDRl的序列也可以是与SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。本专利技术提供的启动子ProPDRl的制备方法为:(I)提取人参根基因组总DNA，以人参根总DNA为模板，构建四个启动子文库'Dral文库、V文库、Pvu II文库和Stu I文库；(2)分别以构建的文库、&0R V文库II文库和I文库为模板，根据人参PgPDRl基因的5'端序列设计引物，进行PCR扩增；(3)胶回收PCR产物，该产物即得本专利技术所述的启动子ProPDRl。在上述方法中，所述步骤(2)中根据人参基因的5'端序列设计的引物为一个引物对:外侧引物和巢式引物，外侧引物如SEQ ID N0.2所示，巢式引物如SEQ ID N0.3所示。本专利技术还提供了含有ProPDRl启动子的重组载体，具体包括:植物表达载体ΡΒΙ121，即就是将ProPDRl启动子连接到空载体ρΒΙ121中，获得ProPDRl启动子驱动的⑶S报告基因的重组载体pBI121-ProroRl::⑶S。ProPDRl启动子亦可克隆到其他空载体中，或制备成转基因细胞及重组菌。本专利技术提供的重组载体pBI121-ProroRl::⑶S的构建方法为:(1)根据ProPDRl启动子序列设计片段相对应的包含lll/Bam HI酶切位点的特异性引物，分别用BamHI和Nco I双酶切pBI 121和启动子ProPDRl，回收pBI 121载体和ProPDRl启动子片段；(2 )将两片段连接并转化DH5a ; (3)通过卡那霉素筛选、PCR和Bam HI/Nco I双酶切鉴定，SP获得所述重组载体pBI121-ProPDRl::⑶S。上述重组载体pBI121-ProPDRl::⑶S的构建中，步骤(I)根据ProPDRl启动子序列设计片段相对应的包含历id lll/Bam HI酶切位点的特异性引物如SEQ ID N0.4和SEQID N0.5所示。步骤(3)中PCR鉴定所设计的引物如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。本专利技术的研究表明具有促进调控人参皂苷转运和积累方面的功能，因此提供了ProroRi启动子以及含启动子的重组载体在调控人参皂苷转运与积累中以及在人参育种中的应用。本专利技术利用植物基因工程技术，根据已克隆的人参PgPDRl基因的5'端序列，采用基因组步查(Genowalker )技术分离ProTORl启动子序列，构建ProTORl::⑶S报告基因的重组表达载体，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入烟草，经过异源表达鉴定证明ProTORl对⑶S报告基因转录与表达的驱动功能。ProTORl启动子驱动的⑶S基因表达具有组织特异性且受水杨酸、赤霉素和人参皂苷等化学物质的诱导，表明所述ProPDRl启动子具有促进调控人参皂苷转运和积累方面的功能。可以通过该启动子或其衍生物 调控或改良人参及其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种，这对于后续克隆人参皂苷转运信号途径中的关键的调控转录因子基因，以及为通过转基因方法调控人参皂苷等萜类化合物的转运与积累等研究奠定了基础。附图说明图1是本专利技术扩增的人参ProPDRl启动子片段电泳结果；图中，I表示PCR扩增产物，M表不Marker ； 图2是本专利技术扩增的人参ProTORl启动子顺式作用元件分析 图3是转基因烟草中扩增的人参ProPDRl启动子片段电泳结果；图中，Γ6表示PCR扩增产物，M表示Marker ； 图4是本专利技术的ProPDRl启动子启动⑶S报告基因在转基因烟草不同组织中的表达水平 图5是本专利技术的ProI3DRl启动子启动⑶S报告基因在20 μ M GA、50 μ M SA、20 μ M ΑΒΑ和20mg/L GS诱导下表达水平图，其中GA为赤霉素、SA为水杨酸、AB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人参皂苷积累的PDR转运蛋白基因启动子，其特征在于，所述的启动子的DNA序列如SEQ?NO.1所示，或是与SEQ?ID?NO.1具有99%以上同源性的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种人参皂苷积累的roR转运蛋白基因启动子，其特征在于，所述的启动子的DNA序列如SEQ N0.1所示，或是与SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。2.根据权利要求1所述的启动子的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤:(1)提取人参根基因组总DNA，以人参根总DNA为模板，构建四个启动子文库'Dral文库、V文库、Pvu II文库和I文库；(2)分别以构建的文库、V文库、II文库和Stu I文库为模板，根据人参作/Wl基因的5'端序列设计引物，进行PCR扩增；(3)胶回收PCR产物，该产物即得本发明所述的启动子ProPDRl。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤(2)中根据人参基因的5'端序列设计的引物为一个引物对:外侧引物和巢式引物，外侧引物如SEQ ID N0.2所示，巢式引物如SEQ ID N0.3所示。4.有权利要求1所述启动子的重组载体，其特征在于:所述重组载体为pBI121-ProroRl::⑶S，其中空载体为ρΒΙ121载体，在ProPDRl启动子的下游连接⑶S报告基因。5.按权利要求4所述的重组载体的...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗志勇，张儒，黄景嘉，陈湘晖，罗俊，李继佳，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：
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