全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用技术

提供了全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用。构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法包括：用Msp?I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切；将DNA片段进行末端修复；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连；将具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；将目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；将经过转换的目的片段进行PCR扩增；分离纯化扩增产物，该扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库。采用本发明专利技术的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法及其应用，能够方便有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体地，涉及全基因组甲基化检测技术，特别是微量DNA全基因组甲基化检测
更具体地，本专利技术提供了一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法、一种确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法、一种用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置、一组分离的限制性内切酶以及一种用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒。
技术介绍
DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，DNA甲基化在维持正常细胞功能、抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。然而，目前对全基因组DNA甲基化的研究仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人的下列发现完成的:减少的代表性重亚硫酸盐测序(RRBS)(参见Smith ZD等人，2009.在哺乳动物基因组中高通量重亚硫酸盐测序(High-throughput bisulfite sequencing in mammaliangenomes)Methods.48:226-232.,通过参照将其全文并入本文)，是目前常用的全基因组甲基化检测方法，其可以检测人类和 鼠基因组中大部分的CpG岛和启动子区域。然而，越来越多的研究显示差异甲基化区域(DMRs)如组织特异性差异甲基化区域(T-DMR)和癌症中的差异甲基化区域(C-DMR)并非仅仅位于CpG岛内，更多的甲基化差异区域位于CpG岛外，如CpG岛外(CGIshores)来调控基因的表达，而这些区域是现有RRBS技术不足以检测到的。另一方面，现有RRBS技术对岛内CG数量的覆盖度低。本专利技术旨在解决现有技术问题的至少之一。由此，为了检测基因组中更多具有代表性区域的甲基化状态并更真实的反应这些区域的甲基化水平，本专利技术提供了全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤:用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以便获得DNA片段，其中，所述第二限制性内切酶为选自BstN 1、HpyCH4V、Alu I,Hae II1、HpyCH4 II,Apek I,Ban I1、Taqa1、Sph I,Bgl II,BssS I,BamH I 和 KpnI的至少一种；将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得具有甲基化接头的连接产物；将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段；将所述经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库。利用根据本专利技术实施例的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，能够有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，特别是能够有效地构建微量样本的全基因组甲基化高通量测序文库，从而能够有效、充分地应用于高通量测序技术，通过对文库的测序，然后基于对测序结果的数据分析，就能够有效地获得全基因组甲基化位点信息，实现对基因组DNA样品的全基因组甲基化检测。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括下列步骤:根据前面所述构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库；对该全基因组甲基化高通量测序文库进行测序，以便得到测序结果；以及对测序结果进行数据分析，以便确定基因组DNA样品的甲基化位点。利用根据本专利技术实施例的确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法，能够准确地确定基因组DNA样品的甲基化位点，从而实现对基因组DNA样品的全基因组甲基化检测，相对于目前的RRBS技术，本专利技术的确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法，对全基因组的调控区域的覆盖广度得到显著提高，对调控区域内CpG位点的覆盖量显著增加。根据本专利技术的再一方面，本专利技术提供了一种用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置。根据本专利技术的实施例，该装置包括:文库制备单元，所述文库制备单元用于制备基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，所述文库制备单元内设置有Msp I酶以及第二限制性内切酶，其中，所述第二限制性内切酶为选自BstN 1、HpyCH4 V、Alu I,HaeII1、HpyCH4 I1、Apek 1、Ban I1、Taqa 1、Sph 1、Bgl I1、BssS 1、BamH I 和 Kpn I 的至少一种；测序单元，所述测序单元与所述文库制备单元相连，并且从所述文库制备单元接收所述基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库，以便用于对所述基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测 序文库进行测序，获得测序结果；以及数据分析单元，所述数据分析单元与所述测序单元相连，并且从所述测序单元接收所述测序结果，以便对所述测序结果进行数据分析，确定所述基因组DNA样品的甲基化位点。利用根据本专利技术实施例的用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置，能够方便准确地确定基因组DNA样品的甲基化位点，可以应用于多种针对全基因组甲基化的研究，例如可以用于对人的肿瘤基因抑制基因的甲基化异常的检测，以便为人类疾病的早期诊断提供有效的途径。根据本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一组分离的限制性内切酶。根据本专利技术的实施例，其由Msp I酶以及第二限制性内切酶构成，其中，所述第二限制性内切酶为选自BstN 1、HpyCH4 V、Alu 1、Hae II1、HpyCH4 I1、Apek 1、Ban I1、Taqa 1、Sph 1、Bgl I1、BssS 1、BamHI和Kpn I的至少一种。根据本专利技术实施例的Msp I酶和第二限制性内切酶构成的组合，能够有效地对基因组DNA进行酶切，且酶切获得的DNA片段非常适用于本专利技术的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒。根据本专利技术的实施例，该试剂盒包括:Msp I酶，以及第二限制性内切酶，其中，所述第二限制性内切酶为选自 BstN 1、HpyCH4 V,Alu I,Hae II1、HpyCH4 II,Apek 1、BanI1、Taq a 1、Sph 1、Bgl I1、BssS I>BamH I和Kpn I的至少一种。利用根据本专利技术实施例的用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒，能够方便有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1:显示了根据本专利技术一个实施例的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法的流程本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：用Msp?I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以便获得DNA片段，其中所述第二限制性内切酶为选自BstN?I、HpyCH4?V、Alu?I、Hae?III、HpyCH4?II、Apek?I、Ban?II、TaqαI、Sph?I、Bgl?II、BssS?I、BamH?I和Kpn?I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为ApekI；将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得具有甲基化接头的连接产物；将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段；将所述经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库；其中，任选地，进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤，优选所述样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种，更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种；任选地，所述基因组DNA为人类全血基因组DNA；任选地，所述基因组DNA的量为150?200ng，优选100ng；任选地，在将所述DNA片段进行末端修复前，进一步包括纯化DNA片段的步骤；任选地，将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’聚合酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性；任选地，将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow(3’?5’exo?)进行的；任选地，所述甲基化接头中包含标签；任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连前，进一步包括对接头进行甲基化的步骤；任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连是利用T4?DNA连接酶进行的；任选地，将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，是通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行的；任选地，所述目的片段的长度为160?420bp；任选地，在将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理之前，将所述目的片段与片段化的λ?DNA混合，优选所述片段化的λ?DNA的量为200ng；任选地，将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理是采用EZ?DNA?Methylation?Gold?KitTM(ZYMO)进行的；任选地，所述PCR扩增使用热启动taq?DNA聚合酶；任选地，所述热启动taq?DNA聚合酶为r?taq聚合酶；任选地，基于所述目的片段的长度，确定所述PCR扩增的循环数，其中，当所述目的片段的长度为160bp以上，且小于240bp时，所述PCR扩增的循环数为11；当所述目的片段的长度为240bp以上，且小于340bp时，所述PCR扩增的循环数为13；以及当所述目的片段的长度为340bp以上，且420bp以下时，所述PCR扩增的循环数为15；任选地，分离纯化所述扩增产物是通过选自磁珠纯化、纯化柱纯化和2％的琼脂糖凝胶电泳的至少一种进行的，优选通过2％的琼脂糖凝胶电泳进行。...

【技术特征摘要】
1.一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤: 用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以便获得DNA片段，其中所述第二限制性内切酶为选自 BstN 1、HpyCH4 V,Alu I, Hae II1、HpyCH4 11 ,Apek I, Ban I1、Taq a Sph 1、Bgl I1、BssS I> BamH I和Kpn I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为 ApekI ； 将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段； 在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段； 将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得具有甲基化接头的连接产物； 将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段； 将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段； 将所述经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及 分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库； 其中， 任选地，进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤，优选所述样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种，更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种； 任选地，所述基因组DNA为人类全血基因组DNA ； 任选地，所述基因组DNA的量为150-200ng，优选IOOng ； 任选地，在将所述DNA片段进行末端修复前，进一步包括纯化DNA片段的步骤； 任选地，将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，所述Klenow片段具有5’ 一 3’聚合酶活性和3’ 一 5’聚合酶活性，但缺少5’ 一 3’外切酶活性； 任选地，将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow (3，-5’ exo_)进行的； 任选地，所述甲基化接头中包含标签； 任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连前，进一步包括对接头进行甲基化的步骤； 任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连是利用T4 DNA连接酶进行的； 任选地，将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，是通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行的； 任选地，所述目的片段的长度为160-420bp ； 任选地，在将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理之前，将所述目的片段与片段化的λ -DNA混合，优选所述片段化的λ -DNA的量为200ng ； 任选地，将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理是采用EZ DNA Methylation-GoldKit (ZYMO)进行的； 任选地，所述PCR扩增使用热启动taq DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，王君文，夏渝东，王俊，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：