全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用技术

提供了全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用。构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法包括：用Msp?I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切；将DNA片段进行末端修复；在经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A；将具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连；将具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段；将目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；将经过转换的目的片段进行PCR扩增；分离纯化扩增产物，该扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库。采用本发明专利技术的构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法及其应用，能够方便有效地构建基因组DNA样品的全基因组甲基化高通量测序文库。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体地，涉及全基因组甲基化检测技术，特别是微量DNA全基因组甲基化检测
更具体地，本专利技术提供了一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法、一种确定基因组DNA样品的甲基化位点的方法、一种用于确定基因组DNA样品的甲基化位点的装置、一组分离的限制性内切酶以及一种用于构建全基因组甲基化高通量测序文库的试剂盒。
技术介绍
DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传学机制，DNA甲基化在维持正常细胞功能、抑制寄生DNA成分对基因组完整性的损害、染色质结构修饰、X染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。然而，目前对全基因组DNA甲基化的研究仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术是基于专利技术人的下列发现完成的:减少的代表性重亚硫酸盐测序(RRBS)(参见Smith ZD等人，2009.在哺乳动物基因组中高通量重亚硫酸盐测序(High-throughput bisulfite sequencing in mammaliangenomes)Methods.48:226-232.,通过参照将其全文并入本文)，是目前常用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：用Msp?I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以便获得DNA片段，其中所述第二限制性内切酶为选自BstN?I、HpyCH4?V、Alu?I、Hae?III、HpyCH4?II、Apek?I、Ban?II、TaqαI、Sph?I、Bgl?II、BssS?I、BamH?I和Kpn?I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为ApekI；将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段；将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化...

【技术特征摘要】
1.一种构建全基因组甲基化高通量测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤: 用Msp I和第二限制性内切酶对基因组DNA进行酶切，以便获得DNA片段，其中所述第二限制性内切酶为选自 BstN 1、HpyCH4 V,Alu I, Hae II1、HpyCH4 11 ,Apek I, Ban I1、Taq a Sph 1、Bgl I1、BssS I> BamH I和Kpn I的至少一种，优选所述第二限制性内切酶为 ApekI ； 将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段； 在所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的DNA片段； 将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连，以便获得具有甲基化接头的连接产物； 将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，以便获得目的片段； 将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理，以便将所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，获得经过转换的目的片段； 将所述经过转换的目的片段进行PCR扩增，以便获得扩增产物；以及 分离纯化所述扩增产物，所述扩增产物构成全基因组甲基化高通量测序文库； 其中， 任选地，进一步包括从样本中提取基因组DNA的步骤，优选所述样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种，更优选所述哺乳动物为人和小鼠的至少一种； 任选地，所述基因组DNA为人类全血基因组DNA ； 任选地，所述基因组DNA的量为150-200ng，优选IOOng ； 任选地，在将所述DNA片段进行末端修复前，进一步包括纯化DNA片段的步骤； 任选地，将所述DNA片段进行末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，其中，所述Klenow片段具有5’ 一 3’聚合酶活性和3’ 一 5’聚合酶活性，但缺少5’ 一 3’外切酶活性； 任选地，将所述经过末端修复的DNA片段的3’末端添加碱基A是利用Klenow (3，-5’ exo_)进行的； 任选地，所述甲基化接头中包含标签； 任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连前，进一步包括对接头进行甲基化的步骤； 任选地，将所述具有粘性末端A的DNA片段与甲基化接头相连是利用T4 DNA连接酶进行的； 任选地，将所述具有甲基化接头的连接产物进行片段选择，是通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行的； 任选地，所述目的片段的长度为160-420bp ； 任选地，在将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理之前，将所述目的片段与片段化的λ -DNA混合，优选所述片段化的λ -DNA的量为200ng ； 任选地，将所述目的片段进行重亚硫酸盐处理是采用EZ DNA Methylation-GoldKit (ZYMO)进行的； 任选地，所述PCR扩增使用热启动taq DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，王君文，夏渝东，王俊，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：