负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法技术

本发明专利技术涉及负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法。具体而言，本发明专利技术利用足月剖腹产产妇废弃的羊膜制备了负载间充质干细胞的大面积的羊膜贴片。本发明专利技术为面积较大的烧伤和褥疮患者的治疗提供了有效的支持，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及及利用该方法获得的负载干细胞的大面积羊膜贴片，以及所述负载干细胞的大面积羊膜贴片在制备治疗大面积褥疮或烧伤的医用材料中的用途。
技术介绍
皮肤是人体与外界环境接触的屏障，不仅起保护、分泌、代谢和感觉等作用，而且参与免疫反应和维持机体内环境的稳定。截至目前，严重创伤和大面积烧伤患者的皮源缺乏一直是临床亟待解决的难题。组织工程皮肤产品开发的成功，使人工皮肤的研究·实现了质的飞跃。目前，已经上市并应用于临床的组织工程皮肤产品有Dermagraft和AetivSkin 等，有一定的临床效果，但仍有一些不足之处而且价格非常昂贵。现有技术中关于组织工程皮片制备的方法主要有1、以成纤维细胞作为滋养层，培养人表皮细胞膜片，其脆性大，移植成功率低。2、以胶原做支架，种植干细胞，构建组织工程化复合皮肤治疗皮肤溃疡。3、用从胎儿脐带血中获取的血管原始祖细胞分化的内皮细胞构建的皮肤替代物，可以促进有免疫缺陷的患者皮损部位血管化的形成。4、以包皮为细胞来源，采用消化法获得角质化细胞、成纤维细胞和黑素细胞，构建组织工程皮肤。早期的烧伤创面覆盖可以限制细菌生长、预防感染、防止水分及电解质的丢失。自体皮肤移植是治疗烧伤的首选，但是对于大面积烧伤，自体皮肤不能满足需求，而异体皮肤能引起明显的免疫排斥。因而，组织工程化皮肤的研究已成为生命科学研究领域的热点之O人羊膜为半透明的薄膜，无血管、神经和淋巴管，有多种促进细胞增殖的营养成分，不表达人类白细胞抗原，具有抗微生物作用和较好的粘附性。目前已有用羊膜移植物治疗眼表损伤疾病的报道。但现有技术多采用直接剥离的羊膜，无任何处理。有的研究者在所述羊膜上负载了自体骨髓间充质干细胞。由于眼部面积较小，所以负载细胞的羊膜贴片很容易进行制备。但大面积负载细胞的羊膜贴片的制备由于受容器限制和其浸泡在培养基中的表面不平整，细胞不易生长，进而使其应用受到限制。以往研究的组织工程皮肤覆盖物不仅价格昂贵，而且技术操作繁琐，有一定的技术难度并且成本造价较高。本专利技术要解决上述应用方面的不足，制备一种操作简单、使用方便、成本低且应用效果好的皮肤缺损修复贴片。由于脐带源间充质干细胞有多项分化潜能，能分化为上皮细胞，且羊膜与脐带为孕妇生产后的废弃物，患者自愿捐献不存在伦理问题。因此，如果能以简便方法制备负载间充质干细胞的大面积的羊膜贴片，将对大面积烫伤等皮肤疾病的治疗提供可资使用的基础材料，具有重要的经济意义和社会意义
技术实现思路
因此，本专利技术的技术目的是找寻可以获取大面积羊膜贴片的方法。因此，本专利技术的第一方面涉及一种，其包括如下步骤I)将取自足月剖宫产产妇的废弃羊膜用PBS洗净，然后用O. 5-5. Og/L的胰蛋白酶消化去除羊膜表面的上皮细胞，2)选取厚度为l_4mm的玻璃板，切割打磨成能放入直径15-25cm的培养皿中的大小，3)将稍大于上述玻璃板的羊膜铺在玻璃板上，多余部分内折，使表面尽量平整，用细胞刮刀反复刮几次去除残留细胞，将膜片连同玻璃板一同放入培养皿内，浸泡在α-ΜΕΜ培养基或者DMEM培养基中，上皮面向上，4°C保存备用，4)将培养好的干细胞以O. 5-2 X IOVcm2密度接种于上述处理好的羊膜上，培养至细胞贴壁，再加入10-50mL含10-20%血清的a -MEM培养基或DMEM培养基，细胞长满后待移植应用。其中，所述大面积指面积在145cm2之上，优选地,所述大面积指面积在180cm2以上、200cm2以上、250cm2以上或300cm2以上。优选地，步骤2)所述玻璃板的厚度为1. 5mm,优选地，所述玻璃板不进行硅烷化处理。优选地，步骤2)所述玻璃板的形状为圆形、方形、长方形，优选地，所述玻璃板的形状为圆形；优选地，所述玻璃板的大小与培养皿的大小尽量接近，以铺上羊膜后能置入培养皿为限；优选地，所述玻璃板的边缘进行打磨处理，以确保光滑、平整、无毛刺或玻璃渣；优选地，所述玻璃板的一面可以固定有大小小于所述玻璃板大小的突起物，以用于辅助固定羊膜，优选地，所述突起物为玻璃或聚丙烯材质，优选地，所述突起物为与玻璃板呈同心圆的圆形突起物或形成平面且使玻璃板平稳地水平置于培养皿中的至少3个栓状突起物。优选地，所述干细胞是间充质干细胞，优选地，所述干细胞是脐带源间充质干细胞。优选地，所述培养皿的直径为18cm ;优选地，所述培养皿为玻璃透明培养皿或聚苯乙烯透明培养皿。优选地，步骤I)中用2. 5g/L的胰蛋白酶消化羊膜表面的上皮细胞；优先地，步骤4)中干细胞的接种量为I X IOVcm2，更优选地，步骤4)中先加入少量a-MEM培养基，在细胞生长至贴壁后再加入10-20ml含10-20%血清的a -MEM培养基。优选地，所述干细胞是第三代脐带源间充质干细胞。本专利技术的第二方面涉及根据上述第一方面所述的获得的负载干细胞的大面积羊膜贴片。本专利技术的第三方面涉及根据上述第一方面所述的获得的负载干细胞的大面积羊膜贴片在制备治疗大面积褥疮或烧伤的医用材料中的用途。换言之，本专利技术利用细胞组织工程技术，用自行专利技术制作的支持物将羊膜固定平整，将人脐带源间充质干细胞种植在人羊膜表面，制备负载干细胞的大面积的人羊膜贴片治疗大面积的皮肤缺损，实现了促进创面愈合的预期目的。本专利技术的有益效果在于，根据本专利技术的技术方案制备的负载脐带源间充质干细胞的羊膜贴片不仅面积相比于现有产品大大增加，而且经过显微镜下的形态学观察发现，所述干细胞在羊膜上生长良好。经免疫荧光染色发现，羊膜贴片上的细胞表达间充质干细胞的表面标志物⑶44和⑶90。虽然现有技术中也有在3cm直径的羊膜上用硝酸纤维素膜作支架贴于基底面，制成贴片用于眼角膜损伤的报道，但该膜片较小，不能覆盖面积大的皮肤缺损。截至目前，还没有在直径为IOcm以上的大羊膜贴片上种细胞的报道。因为细胞贴壁生长的一个条件是需要将要贴壁的表面光滑平整，而羊膜在无支持物的情况下浸到培养液中时，会由于浮力而被泡起，造成表面较多褶皱，使细胞不易贴壁并进而影响其生长和增殖。同时，羊膜应该能容易且平整地固定在支持物上，并置于细胞培养皿中。为了使获得的负载干细胞的大面积羊膜贴片在应用时能尽量完整且紧密地与创面贴合，在 将羊膜原片固定在支持物上时应尽量保持羊膜原片的平整和完整。为此，所述支持物的边缘应平整、光滑、无突起的毛刺或玻璃渣，所述支持物的一面可以固定有用于辅助固定羊膜原片的突起物，所述突起物应使支持物可以稳定地置于培养皿中。同时，虽然理论上来讲，厚度较大的支持物如玻璃板有利于将羊膜原片固定其上，但为避免对后续细胞培养的不利影响(厚度较大时，支持物容易干扰培养液的温度，且使培养皿中的有效培养基的体积减少，导致需要频繁更换培养液，既增加了污染的概率，又造成了不必要的操作)，需要支持物的厚度处于恰当的范围内。同时，为了保持足够的强度，以避免在将羊膜原片固定在支持物上损坏支持物，支持物的厚度也不能过低。经过多次的研究探索，本专利技术发现厚度在l_4mm范围内是可以接受:的，而厚度为1. 5mm的支持物为最佳选择。利用本专利技术所述的方法制备羊膜贴片时，细胞培养皿的大小可以根据需要进行选择。虽然废弃羊膜的大小受正常剖腹产胎儿大小的影响，但其大小普遍可达至少500cm2。因此，本专利技术方法中使用的细胞培养皿的大小仅受本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法，其包括如下步骤：1）将取自足月剖宫产产妇的废弃羊膜用PBS洗净，然后用0.5?5.0g/L的胰蛋白酶消化去除羊膜表面的上皮细胞，2）选取厚度为1?4mm的玻璃板，切割打磨成能放入直径15?25cm的培养皿中的大小，3）将稍大于上述玻璃板的羊膜铺在玻璃板上，多余部分内折，使表面尽量平整，用细胞刮刀反复刮几次去除残留细胞，将膜片连同玻璃板一同放入培养皿内，浸泡在α?MEM培养基或者DMEM培养基中，上皮面向上，4℃保存备用，4）将培养好的干细胞以0.5?2×104/cm2密度接种于上述处理好的羊膜上，培养至细胞贴壁，再加入10?50mL含10?20%血清的α?MEM培养基或DMEM培养基，细胞长满后待移植应用。

【技术特征摘要】
1.一种负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法，其包括如下步骤 1)将取自足月剖宫产产妇的废弃羊膜用PBS洗净，然后用O.5-5. Og/L的胰蛋白酶消化去除羊膜表面的上皮细胞， 2)选取厚度为l_4mm的玻璃板，切割打磨成能放入直径15-25cm的培养皿中的大小， 3)将稍大于上述玻璃板的羊膜铺在玻璃板上，多余部分内折，使表面尽量平整，用细胞刮刀反复刮几次去除残留细胞，将膜片连同玻璃板一同放入培养皿内，浸泡在a-MEM培养基或者DMEM培养基中，上皮面向上，4°C保存备用， 4)将培养好的干细胞以O.5-2X IOVcm2密度接种于上述处理好的羊膜上，培养至细胞贴壁，再加入10-50mL含10-20%血清的a -MEM培养基或DMEM培养基，细胞长满后待移植应用。2.根据权利要求1所述的负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法，其特征在于所述大面积指面积在145cm2之上，优选地，所述大面积指面积在180cm2以上、200cm2以上、250cm2以上或300cm2以上。3.根据权利要求1或2所述的负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法，其特征在于步骤2)所述玻璃板的厚度为1. 5mm，优选地，所述玻璃板不进行硅烷化处理。4.根据权利要求1-3任一项所述的负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法，其特征在于步骤2)所述玻璃板的形状为圆形、方形、长方形，优选地，所述玻璃板的形状为圆形；优选地，所述玻璃板的大小与培养皿的大小尽量接近，以铺上羊膜后能置入培养皿为限；优选地，所述玻璃板的边...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕薇薇，姜丽君，
申请(专利权)人：吉林省拓华生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：