本发明专利技术公开了一株高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉优势菌株及其应用，具体为黑曲霉Aspergillus?nigerC112，于2012年4月23日保藏于《中国典型保藏物中心》，其保藏号为CCTCC?NO:M?2012129。本发明专利技术黑曲霉Aspergillus?nigerC112为紫外诱变后，经初筛、复筛后，获得的遗传稳定的突变菌株。通过适当延长黑曲霉Aspergillus?nigerC112种子培养时间，以麸皮、酵母粉等为原料，经液态发酵，可使β-葡萄糖苷酶酶活达到10IU/mL以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程
，具体涉及一株高效分泌β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，并涉及黑曲霉菌株产β-葡萄糖苷酶的应用。
技术介绍
β -葡萄糖苷酶(EC3. 2.1. 21，β -glucosidase)，也被称作纤维二糖酶，能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解速度较快。在纤维素酶水解纤维素的过程中，葡萄糖苷酶可水解纤维二糖，从而释放出葡萄糖。目前，产纤维素酶的菌株中β -葡萄糖苷酶含量几乎都很低(除黑曲霉外)，如木霉分泌的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶含量还不到1%，远达不到实际应用的水平，因此，β-葡萄糖苷酶成为纤维素酶降解纤维素过程中的瓶颈。除了在降解纤维素方面有着重要作用外，葡萄糖苷酶在其他领域应用也越来越广泛，包括食品、酿酒、医药、化学等行业。近年来，国内外许多科`学家致力于β -葡萄糖苷酶的研究，期望更好改善纤维素酶的催化效率，利用纤维素资源。在提高产酶效率的方式中，诱变育种是一种非常有效的手段。诱变育种是利用人工诱变来诱发微生物基因突变，从而筛选出产量高、性能优良的突变体，具有速度快、收效大、方法简单等优点。紫外线诱变等物理诱变方法以及硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)等化学诱变方法一直是学者们研究的热点。宋小炎等人以实验室保存的拟康氏木霉为出发菌株，经紫外诱变处理，用葡萄糖(梯度浓度)纤维素双层平板选育，在含葡萄糖(4%)纤维素双层平板上获得一株葡萄糖浓度高达10%仍能产生纤维素水解透明圈的突变株UV III，培养6d，干曲的β-葡萄糖苷酶活力可达24U/g，是出发菌株的12. 6倍。王德培等人通过分离筛选和紫外诱变法，距离30W紫外灯15cm，照射时间O. 5_3min，选出一株高产纤维素酶黑曲霉菌株S13并进行了最佳固态发醉培养条件的研究，在最佳条件下，其葡萄糖苷酶活力达801. 18mg/(h · g)。苏香萍等人以黑曲霉菌株SI为原始菌株进行紫外诱变，在15W紫外灯下，照射距离30cm左右，照射时间为9min，筛选获得一株高产纤维素酶黑曲霉菌株S12，在pH6. 0，培养温度28 V，培养时间96h条件下，β-葡萄糖苷酶活力相比较原始菌株酶活提高了的1. 13倍。虽然，针对黑曲霉产β _葡萄糖苷酶研究报道有许多，但其产酶效率仍然还有极大的提升潜力。紫外线作为一种常用的物理诱变剂，它的诱变频率高，且不容易发生突变恢复。本专利技术的目的是采用紫外诱变的方式对现有黑曲霉菌株进行突变筛选，以期获得更加稳定、高产葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株。
技术实现思路
本专利技术在于提供一株高产β -葡萄糖苷酶的黑曲霉优势菌株及其应用。一株产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株为黑曲霉Aspergillus nigerC112，其保藏号为 CCTCCNO:M 2012129。所述的黑曲霉菌株用于产β -葡萄糖苷酶。具体是将黑曲霉Aspergillus nigerC112经液体发酵,产β_葡萄糖苷酶。所述的黑曲霉Aspergillus nigerC112产酶过程为固体平板孢子,经PDA液体培养基25-30°C活化48-72小时，按3-10%接种量，转接入液体产酶培养基中，pH至4. 5-6. 0，26-30°C下，培养96小时至144小时。所述的PDA液体培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，其余为水，自然pH值。所述的液体产酶培养基为麸皮10g/L，酵母粉5g/L，硫酸铵2. 8g/L，KH2P044g/L,MgSO4 · 7H20 O. 9g/L，CaCl2O. 9g/L，吐温 2mL/L，其余为水。 本专利技术的黑曲霉Aspergillus niger C112，2012年4月23日保藏于《中国典型保藏物中心》，地址为中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC N0:M2012129o所述的黑曲霉菌株Aspergillus niger C112特征为菌株在FDA种子培养基上,25-30°C下培养96-144小时，菌丝体成丝绒状或絮状，顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状。分生孢子头球状，有大量分生孢子，分生孢子全面可育，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，黑褐色，无渗出液，菌落背面无色或中央略带黄褐色淡黄色。附图说明图1为本专利技术黑曲霉Aspergillus nigerC112固体平板正面照片；图2为本专利技术黑曲霉Aspergillus nigerC112固体平板背面照片；图3为本专利技术黑曲霉Aspergillus nigerC112显微镜下菌丝体照片(400x)图4为本专利技术黑曲霉Aspergillus nigerC112显微镜下孢子照片(400x)。具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。本专利技术用黑曲霉菌株Aspergillus nigerACCC No 30786进行紫外诱变，黑曲霉菌株Aspergillus nigerACCC No 30786在PDA平板培养基上28°C培养5-7d。PDA培养基为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。取平板菌种，加无菌生理盐水洗下孢子，四层纱布过滤至盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，28°C振荡2h，使孢子分散，调整其浓度为106/mL。将上述的菌悬液取ImL稀释至10' 10' 10' 1(Γ7倍后涂布平板，然后再取IOmL于直径为9cm的培养皿中，磁力搅拌下距20W紫外灯35cm，处理50min。将照射后的菌液稀释涂布于分离平板上，在分离平板中培养2d后，开始形成单菌落。分离培养基(w/v) :土豆20%，葡萄糖2%，琼脂1. 5%，甘油10%,去氧胆酸钠O. 1%，自然pH。28°C培养1. 5_2d。将平皿上分离出的单菌落用牙签挑入筛选培养皿中，28 °C培5d后，喷洒Imol/LNa2CO3显色，挑取黄色较深的菌株直接进行复筛。筛选培养基土豆20%，葡萄糖2%，琼脂1. 5%，自然pH, p-NPGO. 1%(灭菌冷却至60°C左右加入)。将初筛得到的酶活相对较高的菌株通过摇瓶发酵，每个菌株接I瓶，28°C培养，5d后测其β -葡萄糖苷酶酶活。产酶培养基麸皮1%，玉米芯2. 15%，酵母粉O. 5%，硫酸铵O. 68%, KH2 (PO4) O. 4%, MgSO4 · 7H20 O. 09%, CaCl2O. 09%,吐温-802 滴 / 瓶，调节 pH 为 5. 2。将复筛得到的产酶较高的菌株进行再次复筛，每株3瓶，28°C培养，5d后测其β -葡萄糖苷酶酶活。对筛选获得的高活性的突变株进行继代培养，连续继代8次，测其β -葡萄糖苷酶酶活，观察其稳定性，获得了酶活较高、遗传稳定的黑曲霉Aspergillus nigerC112。连续继代8次后，其β -葡萄糖苷酶酶活达到6. 510U/mL，相对于出发菌株提高了 49. 31%。利用pNPG法测定β -葡萄糖苷酶酶活取O.1mL稀释了适当倍数的粗酶液，加入lmLpH4. 8的O. 05mol/L朽1檬酸缓冲溶液,于5(TC水浴预热IOmin ;加入已预热IOmin的O. 9mL5mmol/LpNPG溶液,计时，IOmin后立即加入ImL lmol/LNa2C03溶液终止反应加入蒸懼水定容到25m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产β?葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，其特征在于，所述的黑曲霉菌株为黑曲霉AspergillusnigerC112，其保藏号为CCTCC?NO:M?2012129。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈介南，张林，刘进，陈石兰，王义强，石彩蕊，先天敏，石旺，马云中，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，长沙联美生物科技有限责任公司，常德联合生物能源研究所，
类型：发明
国别省市：
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