本发明专利技术公开了一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的靶物质进行定性与定量检测的方法，包括向待测标本中加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素包被靶物质抗体、链亲和素（SA）包被的感光微球进行第一次免疫反应和检测的步骤，还包括向反应体系中加入抗He试剂发生靶物质免疫叠加反应，并进行第二次光激发化学发光免疫检测的步骤。本发明专利技术通过对两次LiCA检测结果的综合分析达到全方位纠正Hooks效应的目标，分析过程包括根据其在一次LiCA与二次LiCA检测的信号特征将被检标本区分为阴、低阳、中阳，高阳与超高阳等五个浓度区间；根据第一次LiCA对低阳与超高阳浓度区段的标本进行定量分析。本发明专利技术具有结果准确，操作简便，适用范围广等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学领域中的标记免疫分析方法，具体涉及一种采用光激发化学发光(Light initiatd Chemiluminescence Assay, LiCA)免疫分析对血清中的祀物质进行定性与定量检测的方法。
技术介绍
均相免疫指全部的反应与结果的观察均在均一的液相界面进行的免疫学检测方法，操作简洁是均相免疫的主要特征。光激发化学发光(LiCA)免疫分析是这类方法的主要代表，亦是目前已经商品化的主要均相免疫技术之一，与酶联免疫分析(ELISA)、电化学发光免疫分析等固相免疫分析相比，LiCA免疫分析涉及时间分辨荧光，纳米微球研究，受体(生物素与亲和素)固定，特殊的能量转递方式及均相免疫反应等多种前沿科学成果，其技·术含量最高，实验操作最简洁，但因Hooks效应的影响妨碍了其市场推广。Hooks效应即钩状效应，其表现为当反应体系中待测物质(包括抗原或抗体)的浓度升高到一定程度后，检测信号反而下降或显著下降，甚至出现假阴性结果，由此造成的后果首先是个别靶物质含量极高的强阳性标本表现出假阴性，其次为阳性标本中大约10 30%左右强阳性标本，被误判为弱阳或低浓度阳性。这种存在于多种血清学检测中的量(待测物浓度)效(检测信号)分离现象的产生虽可能与待测免疫分子的结构相关，但反应体系中靶物质与对应免疫物质比例的高度失调是其最主要的原因。这一效应如果发生于某些特殊临床检测如血清HBsAg的筛选，则可造成大量临床标本的定量检测结果偏离真值，部分强阳性标本测值降低或显著降低，甚至导致个别具有高度传染性的强阳性标本出现假阴性结果。如果这种漏检发生在献血员筛选，则势必导致受血者发生输血相关性肝炎的严重临床事件。鉴于血清HBsAg检测的范围及其社会影响面极大，我国已明令禁止“一步法”检测在献血员HBV感染者筛选中的应用。通过近十余年的努力，对Hooks效应干扰的认识已有很大提高，针对固相免疫实验中的Hooks效应纠正方法不断出现。但由于反应方式的大相径庭，这些方法都不能用于均相免疫实验，而有效拮抗均相免疫中Hooks效应影响的方法迄今尚未见报道与公布。均相与固相免疫的主要差别，还在于全部的固相免疫试验在操作上均存在一次甚至多次已反应物与未反应物质的分离，而均相免疫在整个的实验过程中，尤其是实验信号的米集完成后，试剂体系中的未反应物单独或与反应后物质一道存在于同一反应孔(管)中，并很好地保留着与随后加入靶物质结合的能力，这一差别，为“靶物质叠加反应”在均相免疫实验中的实施提供了契机。此外，免疫学检测方法的定量检测范围通常均较为局限，敏感性越高的试验方法其定量范围通常越窄，发光分析虽然在一定程度上能纠正这一现象，然而在兼顾方法敏感性，特异性，稳定性及试剂成本的前提下，其定量检测范围亦仅在1000ng/ml左右。如何采用单一检测对多数靶物质实施全程或亚全程定量分析已经成为制约免疫学技术发展的重要技术瓶颈。血清学免疫检测技术至少包括固相与均相免疫两类，能接受本专利措施的血清免疫学检测实验方法须具备以下前提。①不发生试剂系统对靶物质的结合能力的自消耗不发生已反应物与未反应物间的相互分离与清除“未参与反应的试剂”能在系统中较长时期保留与靶物质反应并生成检测信号的能力。符合上述条件的实验方法多集中在均相免疫实验，光激发化学发光免疫分析(LiCA)是其中的重要代表。现有血清免疫学试验尽管存在上述缺点，但在技术发展上均达到或基本达到在当前物质与技术条件下该技术可具备的最佳的状态。包括合理的实验步骤与反应条件，完善的试验操作与检测系统(仪器)，稳定的试剂质量，以及良好地检测品质(高度的特异性敏感性与稳定性)等。部分还预留进一步完善与发展的技术方向。本专利专利技术以上述各实验方法的最新技术成果为基础，全盘接受上述试验技术发展所取得的优良技术特征，不排斥正在或将要进行的适合本专利技术实施的任何技术革新与改造，为适应本专利实施所进行的相关改造(包括试剂改造与实验仪器改造)亦以不妨碍原有试验的操作以及技术特征的充分发挥为前提。
技术实现思路
本专利技术的目的是对现有的光激发化学发光免疫分析方法进行改进，提供一种能纠正Hooks效应并扩大定量检测范围的光激发化学发光免疫分析方法。上述目的是通过以下技术方案实现的一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性或定量检测的方法，包括如下步骤向血清中依次加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球，混匀后温育以发生免疫反应；然后用激发光激发上述免疫反应后的反应体系，并第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度，检测出的光子信号强度依据靶物质浓度与发光信号强度的标准曲线关系，第一次确定靶物质含量；在第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度后，向免疫反应后的反应体系中加入抗He试剂，混匀后温育发生免疫叠加反应；然后用激发光激发上述免疫叠加反应后的反应体系，并第二次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度；根据第一次和第二次的光子信号强度推导新的靶物质含量与信号强度的关系，并据此计算待测标本中的靶物质浓度所述的反应体系与抗He试剂的体积比为5-50:1，当所述待测靶物质为抗原时，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为10_200000ng/ml ；当所述待测靶物质为抗体时，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为I. 0-20000IU/ml ο当所述待测靶物质为抗原(如血清HBsAg)时，优选的抗He试剂中靶物质的浓度为2000ng/ml。当所述待测靶物质为抗体(如血清抗HBc)时，优选的抗He试剂中靶物质的浓度为1000IU/ml。优选的，所述的反应体系与抗He试剂的体积比为10:1。优选的，所述激发光波长为680nm,发射光波长为610_615nm。所述包被靶物质抗体的发光微球的浓度为lO-lOOPg/ml，所述生物素标记的靶物质抗体浓度为I. O-lOPg/ml，所述链亲和素包被的感光微球浓度为lO-lOOPg/ml，所述血清与包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球的体积比依次为1:1:1:7。所述室温下温育的时间为5-60分钟。所述上述各项试验条件，以能产生足以可供分析的试验信号，并以不发生对试验效果的干扰为前提，由于本专利主要专利技术点为抗He介入及其靶物质叠加免疫反应，现阶段LiCA检测部分的主要实验条件(即优选实验条件)的选择依据市售试剂的规定，并接受可能出现的适宜本专利实施的改进；所述的方法在血清HBsAg、抗HBc、AFP定性和定量检测中的应用。在LiCA检测中，当第一次LiCA反应及其检测完毕后，包括标本在内的全部的反应体系仍旧存在于反应孔中。阴性，及其低浓度阳性孔中的抗体或包被了抗体与亲和素的发光微球未经或仅部分与靶物质(如抗原)发生反应，全部或多数抗体或包被了抗体的发光微球得以保留并具备与后续加入的靶物质发生反应的能力，其反应强度足以使第二次LiCA检测所获得的信号(单独或与一次LiCA反应信号叠加)达到饱和或过饱和状态。在“靶物质叠加反应”过程中能与随后加入的靶物质(其浓度以能产生可供识别与分析的试验信号为度，通常以产生饱和LiCA信号的靶物质的2倍为佳)发生反应并产生新的实验信号，这一信号与第一次LiCA检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性或定量检测的方法，包括如下步骤：向血清中依次加入包被靶物质抗体的发光微球、生物素标记的靶物质抗体、链亲和素包被的感光微球，混匀后温育以发生免疫反应；然后用激发光激发上述免疫反应后的反应体系，并第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度，检测出的光子信号强度依据靶物质浓度与发光信号强度的标准曲线关系，第一次确定靶物质含量；其特征在于：在第一次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度后，向免疫反应后的反应体系中加入抗He试剂，混匀后温育发生免疫叠加反应；然后用激发光激发上述免疫叠加反应后的反应体系，并第二次检测反应体系所发出的发射光的光子信号强度；根据第一次和第二次的光子信号强度推导新的靶物质含量与信号强度的关系，并据此计算待测标本中的靶物质浓度：所述的反应体系与抗He试剂的体积比为5?50:1；所述待测靶物质为抗原时，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为10?200000ng/ml；所述待测靶物质为抗体时，所述的抗He试剂中靶物质的浓度为1?20000IU/ml。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李方和，李时君，
申请(专利权)人：李方和，
类型：发明
国别省市：
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