一种胃蛋白酶原Ⅱ的光激发化学发光检测方法及试剂盒技术

一种胃蛋白酶原Ⅱ的光激发化学发光检测方法及试剂盒，属于光激发化学发光免疫分析技术领域。本发明专利技术方法为：在均相反应体系中，微量的胃蛋白酶原Ⅱ标准品或样品、包被有抗胃蛋白酶原Ⅱ一株高效价单抗的发光微粒和生物素化抗胃蛋白酶原Ⅱ的另一株单克隆抗体，在微孔板中避光反应，随后加入包被有链霉亲和素的感光微粒，孵育后检测。利用生物素-链霉亲和素的放大效应和高效价的单克隆抗体，以及光激化学发光原理，达到血清不需要稀释直接反应检测，反应时间很短、灵敏度高、特异性好、测量范围宽、操作简单，便于临床使用，利于大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种血清(血浆)中胃蛋白酶原II的光激发化学发光检测方法及试剂盒，属于体外试剂诊断领域中血清(浆)抗原的光激发化学发光检测方法，用于实施疾病诊断和治疗方法的仪器或装置， 属于光激发化学发光免疫分析

技术介绍
胃蛋白酶原(简称PG)是反映胃部状态的功能性指针——胃蛋白酶无活性前体，胃蛋白酶原II (简称PG II )来源于全胃腺和远端十二指肠Brunner氏腺，胃粘膜合成的PG II约为总量的25%，PG II大部分进入消化道，少量进入血液循环，因此被称为“反映胃部状态和功能的指针”。其水平的变化可以直接反映胃粘膜和十二指肠状态和细胞数量的改变。国内外临床研究指出，PG II与胃底粘膜病变的相关性较大，其升高与胃底腺管萎缩、肠上皮化生或假幽门腺化生、异型增生有关。测定PG II含量有助检测出十二指肠溃疡、萎缩性胃炎、胃炎、胃癌等其他消化道疾病，供临床检测和体检筛查需求。在人群胃病筛查中，每个人做胃镜是不现实的，可通过非侵入性血清PG检测将浅表性胃炎、糜烂性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃癌等高危人群筛查出来，再进行胃镜检查是一种切实可行的方案。PG I /PG II比值是胃癌筛查的重要指标之一。PG II检测作为非侵入性方法，降低患者痛苦，简便、经济，具有普查价值。光激发化学发光免疫分析技术是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发光免疫技术，该项技术前景广阔，将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。又称为AlphaLISA分析法，被誉为免洗的ELISA。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技术，它具有快速、均相(免洗)、高灵敏、量程宽和操作简便的特点。其试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm，表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒表面覆盖着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。该技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200 nm)。如果发光微粒在200nm范围之内就能接受单线态氧，并发出高能级的光(520 nm-620nm)。相反，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是其均相反应的基础。通常在该反应体系中，微粒的浓度是很低的，两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了两个微粒的距离，例如形成免疫夹心或受体-配体复合物，这样就能产生能量的有效传递并发出光信号。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供出一种新型的PG II的光激发化学发光检测方法及试剂盒，运用生物素-链霉亲和素(包括亲和素)的放大效应和先进的光激发化学发光检测技术，将双抗夹心法的信号放大，达到高灵敏、特异性好、量程范围宽、反应时间短的目的。本专利技术的技术方案一种血清胃蛋白酶原II光激发化学发光检测方法，基于光激发化学发光免疫分析法，将链霉亲和素-生物素放大系统引入胃蛋白酶原II双抗夹心体系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗胃蛋白酶原II的一株高效价单抗的发光微粒和连有生物素的抗胃蛋白酶原II的另一株单克隆抗体溶液，及胃蛋白酶原II标准品或样品，避光反应，随后加入包被有链霉亲和素的感光微粒，孵育后检测。所述的胃蛋白酶原II光激发化学发光检测方法所用的试剂盒，由白色不透明微孔板(1)，胃蛋白酶原II标准品(2)，连有抗胃蛋白酶原II单克隆抗体的发光微粒(3)，生物素化抗胃蛋白酶原II单克隆抗体溶液(4)和包被有链霉亲和素的感光微粒(5)组成，胃蛋白酶原II标准品浓度范围0-50ng/mL。 将一株抗PG II抗体与发光微粒偶联，另一株抗PG II抗体与生物素连接，在均相体系中形成感光微粒-抗体-抗原-抗体-生物素的复合物。通过链霉亲和素，感光微粒与双抗夹心复合物免疫夹心，实现感光微粒与发光微粒的特异性接近，从而实现能量传递，发出荧光信号，并被仪器测量出来。本专利技术的有益效果一、灵敏度高,检测至I. Ong/mL ;二、量程宽，血清(浆)样本不需要稀释样品浓度值介于0-50ng/mL的都能准确检测；三、检测时间短，从样品孵育到检测,约0. 5小时完成；四，样品需求量少,一次上样只需20ML。附图说明图I :PG II光激发化学发光检测试剂盒的组成示意图；1、白色不透明微孔板，2、包被有PG II单抗的发光微粒，3、PG II标准品一套，4、生物素化PG II单抗溶液，5、包被有链霉亲和素的感光微粒。图2 :PG II光激发化学发光免疫反应示意图。图3 PG II光激发化学发光免疫反应标准曲线图。具体实施例方式实施例I 包被有PG II单抗的发光微粒制备 在离心管中加入Img发光微粒，加入12. 5 ML 1% Tween-20,0. 05 mg PG II单抗，IOML硼氢化氰钠，用0. lM、pH 6. 0的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液将体积补充到200^,37°C避光振荡反应48小时。加入IOML 0.3 M pH 5. 0的羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37°C避光孵育I小时后离心，分离得到已连接PG II单抗的发光微粒，稀释后备用。PG II光激发化学发光检测试剂盒的制备 试剂盒的组成 (I)、白色不透明微孔板(12条X8孔，可以拆分为单孔)。(2)、1X 包被有 PG II 单抗的发光微粒(50l^g/mL) :2mL。(3)、6XPG II 标准品，0. 5mL/瓶，标准液浓度为0，5，10，20，30，50ng/mL。(4)、I X 生物素化抗 PG II 单抗溶液(10Pg/mL)，15mL。(5)、1X包被有链霉亲和素的感光微粒(20l^g/mL) :20mL。在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。PG II光激发化学发光检测 取包被有PG II单抗的发光微粒、PG II标准品或处理好的样品、一定浓度的生物素化抗PG II单抗三种试剂，各20ML加到白色不透明微孔板，37°C孵育20分钟；加入175ML包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C孵育10分钟；在光激化学发光检测仪上检测光信号。结果处理根据标准品浓度和对应荧光值绘制标准曲线，将样品的荧光值代入标准曲线中，计算得到样品中PG II含量。表I :显示PG II光激发化学发光检测结果，其中第一列代表PG II浓度，第二列代表荧光计数值(cps)，夹心法测试实验结果如表I所示。表I :显示PG II光激发化学发光检测结果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清胃蛋白酶原II光激发化学发光检测方法，其特征在于基于光激发化学发光免疫分析法，将链霉亲和素-生物素放大系统引入胃蛋白酶原II双抗夹心体系中，在白色不透明微孔板中加入包被有抗胃蛋白酶原II的一株高效价单抗的发光微粒和连有生物素的抗胃蛋白酶原II的另一株单克隆抗体溶液，及胃蛋白酶原II标准品或样品，避光反应，随后加入包被有链霉亲和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艺，黄飚，张珏，周彬，王柯，朱岚，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，无锡市江原实业技贸总公司，
类型：发明
国别省市：