本发明专利技术公开了一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，包括以下步骤：1)纳米金溶液制备，0.01％w/w的HAuCl4溶液加热至沸，强力搅拌下加入1％的柠檬酸钠溶液，混合溶液保持沸腾15分钟后撤掉加热源，而后不断搅拌冷却至室温，得到的溶液于4℃冰箱中保存备用；2)铁蛋白抗体对纳米金的标记，利用铁蛋白抗体修饰金纳米颗粒；3)免疫反应；4)化学发光分析检测铁蛋白，移取免疫反应完的铁蛋白抗体修饰的纳米金/铁蛋白混合液于化学发光池中，注入鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂，通过IFFL-D化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度，得出化学发光强度和待测铁蛋白之间的相关关系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物检测
，具体的说，本专利技术涉及一种基于纳米金催化的化 学发光分析检测铁蛋白的方法。
技术介绍
铁蛋白是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中含高铁量的蛋白质，能够参与和 维持铁代谢的平衡。人体内铁蛋白可以通过储存机体中的过剩铁，避免产生铁中毒，也可 以释放铁给需铁细胞，用于合成含铁的蛋白质或酶。人们的许多疾病如缺铁性贫血、急性 肝炎及蛋白质缺乏症等都与血清中铁蛋白的含量有关，甚至某些癌症患者体内的铁蛋白也 会出现异常，可作为一些癌症的辅助诊断，因此对铁蛋白进行准确快速的测定具有重要的 意义。目前，铁蛋白的测定主要采用酶联免疫分析（ELISA)法，放射性免疫法、电化学分 析方法、表面等粒子共振技术、荧光分析以及很少的化学发光分析等。但是，放射性免疫法 因使用放射性同位素作为标记，必然会带来健康危害、废物处理等问题。寥寥可数的化学发 光分析和酶联免疫法存在步骤繁多的缺点，而不适用于各种生物标记的检测。别的分析方 法大多需要复杂、费时的样品处理和贵重的分析仪器以及具有一定技术要求的操作人员， 使得这些方法的应用受到一定限制。 化学发光分析以其灵敏度高、线性范围宽以及操作简单等优点常被用作各种免疫 分析的最终检测手段，然而有些化学发光体系〔例如鲁米诺一 H202 - HRP(辣根过氧化物 酶）〕直接用于免疫分析时大分子的空间位阻作用使方法的灵敏度不够理想。在纳米科学 迅猛发展的过程中，纳米粒子尤其金属纳米粒子因其具有容易合成和生物相容性好等优点 已被引入化学发光分析，开创纳米粒子化学发光生物分析的新领域，一度成为研究的热点。 但是大多基于纳米粒子标记的化学发光免疫分析，均是通过将所标记金属纳米粒子溶出为 金属离子，从而催化化学发光反应实现对目标物的检测。Han研究组报道了基于纳米金溶解 并结合AuCl 4^-HCl-NaCl-Br2-luminol体系的化学发光金属免疫分析法，用于抗坏血酸过氧 化物酶抗体（ApxIVAb)的测定。Li研究组和Lu研究组相继利用将标记所用纳米金溶解得 到AuC1 4_，结合AuCl4_-luminol-H202化学发光体系测定羊抗人IgG。此外，Li研究组利用将 标记的纳米金用Ag+还原溶液处理后，经硝酸溶出后，结合Ag+-Mn 2+-K2S208-H3P0 4-luminol化 学发光体系测定人IgG。上述这些纳米粒子化学发光金属免疫分析方法存在一定缺陷：一、 需要将纳米金属离子的溶出，要使纳米粒子尤其贵金属纳米粒子完全溶出的的条件均比较 苛刻且所用溶剂大多有毒。溶出步骤繁琐耗时，且会带来高的背景信号，从而降低方法的灵 敏度；二、这些分析方法大多是异相的，需要多步的标记和洗脱，从而难以克服重现性和精 密度的问题。
技术实现思路
本专利技术针对目前铁蛋白检测技术存在的不足，以免疫特异性反应为分子识别基 础，纳米金为信号探针，利用纳米金形态影响其对鲁米诺-高碘酸钾化学发光反应的催化 性能，建立了一种简便、快速灵敏的化学发光分析检测铁蛋白的方法。 本专利技术提供的技术方案是：一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方 法，包括以下步骤： 1)纳米金溶液制备，0. 01% w/w的HAuC14溶液加热至沸，强力搅拌下加入1%的 柠檬酸钠溶液，混合溶液保持沸腾15分钟后撤掉加热源，而后不断搅拌冷却至室温，得到 的溶液于4°C冰箱中保存备用； 2)铁蛋白抗体对纳米金的标记，利用铁蛋白抗体修饰金纳米颗粒，具体为：将铁 蛋白抗体修饰在纳米金粒子的表面，取纳米金溶液用〇. lmol/L K2C03溶液调节pH为9,加 入铁蛋白抗体，室温搅拌作用1小时使铁蛋白抗体和金纳米粒子充分结合，于4°C温度环境 下以12000转/分的速度离心30分钟，以除去未标记的抗体，吸出上清液，剩余的沉淀用 0. Olmol/L含有1 % BSA的磷酸缓冲溶液pH7. 4悬浮至原体积，于4°C冰箱中保存待用； 3)免疫反应，免疫反应选用NaCl浓度为1. 5X10_3mol/L，免疫反应时间为15-25 分钟； 4)化学发光分析检测铁蛋白，移取免疫反应完的铁蛋白抗体修饰的纳米金/铁蛋 白混合液于化学发光池中，注入鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂，通过IFFL-D化学发光分 析仪测定并记录其化学发光强度；通过测定化学发光强度检测铁蛋白的含量，由此可以得 出化学发光强度和待测铁蛋白之间的相关关系。 所述的步骤1)中，选用的纳米金的粒径为25nm，浓度为6. 0 X Krlclmol/L? 6. 0Xl(T8mol/L 之间。 所述的步骤2)中，标记铁蛋白抗体所用浓度为0. 5mg/mL。 所述的步骤4)中，选择鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂为5Χ1(Γ4Μ鲁米诺和 5. ΟΧ 1(Γ2Μ高碘酸钾的体积比为2:1混合而成。 鲁米诺-高碘酸钾化学发光试剂的pH值优化为12. 0。 本专利技术的有益效果是： 将纳米粒子对于化学发光反应的催化性能和高特异性的免疫分析相结合，实现铁 蛋白的分析检测至今仍未见报道。因此，本专利技术基于纳米金形态影响其对化学发光反应的 催化性能，而建立的实用性、简单、灵敏且快速化学发光分析测定铁蛋白的方法很有意义， 能够解决上述检测方法遇到的问题。具有以下优点：（1)所用化学发光仪价格低廉且操作 简单；（2)避免繁琐和艰难的纳米金（或银）的溶解剥离，具有高的灵敏度和好的重现性； (3)所用的25nm纳米金的合成简便且易于标记；(4)该方法只需要非竞争的一步操作，避免 了多步反应及洗脱步骤，大大节省了分析时间，将测试时间缩短为30分钟以内。 【附图说明】 当结合附图考虑时，通过参照下面的详细描述，能够更完整更好地理解本专利技术以 及容易得知其中许多伴随的优点，但此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解， 构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本发 明的不当限定，其中： 图1抗体用量的优化，纳米金浓度固定为0. 6nM，所测吸光度为波长520nm处； 图2免疫反应时间的影响，条件：鲁米诺，5X 10_4M ;高碘酸钾，5. OX 10_2M ; 图3盐浓度的影响，条件：鲁米诺，5X 10_4M ;高碘酸钾，5. OX 10_2M ; 图4化学发光反应动力学曲线；图中自下至上分别为没有纳米金，纳米金，纳 米金+铁蛋白抗体，纳米金+铁蛋白抗体+铁蛋白；条件：鲁米诺，5X 1(Γ4Μ ;高碘酸 钾，5· 0Χ1(Γ2Μ ; 图5测定铁蛋白的灵敏度分析； 图6测定铁蛋白的特异性评价；注（a)铁蛋白，（b)牛血清白蛋白（BSA)，（c)人免 疫球蛋白G(IgG)，⑷羊免疫球蛋白G IgG，（e)兔免疫球蛋白G IgG，（f) α -胎儿蛋白抗原 (AFT)； 图7方法可靠性的评价； 图8纳米金透射电镜图；图8a为纳米金+铁蛋白抗体，图8b为纳米金+铁蛋白 抗体+铁蛋白。 【具体实施方式】 为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实 施方式对本专利技术作进一步详细的说明。 所用到的主要仪器设备和试剂： IF本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)纳米金溶液制备，0.01％w/w的HAuCl4溶液加热至沸，强力搅拌下加入1％的柠檬酸钠溶液，混合溶液保持沸腾15分钟后撤掉加热源，而后不断搅拌冷却至室温，得到的溶液于4℃冰箱中保存备用；2)铁蛋白抗体对纳米金的标记，利用铁蛋白抗体修饰金纳米颗粒，具体为：将铁蛋白抗体修饰在纳米金粒子的表面，取纳米金溶液用0.1mol/L K2CO3溶液调节pH为9，加入铁蛋白抗体，室温搅拌作用1小时使铁蛋白抗体和金纳米粒子充分结合，于4℃温度环境下以12000转/分的速度离心30分钟，以除去未标记的抗体，吸出上清液，剩余的沉淀用0.01mol/L含有1％BSA的磷酸缓冲溶液pH7.4悬浮至原体积，于4℃冰箱中保存待用；3)免疫反应，免疫反应选用NaCl浓度为1.5×10‑3mol/L，免疫反应时间为15‑25分钟；4)化学发光分析检测铁蛋白，移取免疫反应完的铁蛋白抗体修饰的纳米金/铁蛋白混合液于化学发光池中，注入鲁米诺‑高碘酸钾化学发光试剂，通过IFFL‑D化学发光分析仪测定并记录其化学发光强度；通过测定化学发光强度检测铁蛋白的含量，由此可以得出化学发光强度和待测铁蛋白之间的相关关系。...
【技术特征摘要】
1. 一种基于纳米金催化的化学发光分析检测铁蛋白的方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 纳米金溶液制备，0.01 % w/w的HAuC14溶液加热至沸，强力搅拌下加入1 %的柠檬 酸钠溶液，混合溶液保持沸腾15分钟后撤掉加热源，而后不断搅拌冷却至室温，得到的溶 液于4 C冰箱中保存备用； 2) 铁蛋白抗体对纳米金的标记，利用铁蛋白抗体修饰金纳米颗粒，具体为：将铁蛋白 抗体修饰在纳米金粒子的表面，取纳米金溶液用〇. lmol/L K2C03溶液调节pH为9,加入 铁蛋白抗体，室温搅拌作用1小时使铁蛋白抗体和金纳米粒子充分结合，于4°C温度环境 下以12000转/分的速度离心30分钟，以除去未标记的抗体，吸出上清液，剩余的沉淀用 0. Olmol/L含有1 % BSA的磷酸缓冲溶液pH7. 4悬浮至原体积，于4°C冰箱中保存待用； 3) 免疫反应，免疫反应选用NaCl浓度为1.5Xl(T3m〇l/L，免疫反应时间为15-25分钟； 4) 化学发光分析检测铁蛋白，移取免疫反应完的铁蛋白抗体修饰的纳米金/铁蛋白混 合液于化学...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐莹莹，修福荣，
申请(专利权)人：福建工程学院，
类型：发明
国别省市：福建;35
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