本发明专利技术经辐照诱变得到了一株新的纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160。与野生菌BSNK-5相比，BSNK-T160的酪蛋白水解活性提高了46.9%，65℃热稳定性提高约8倍；相对于尿激酶的纤维蛋白活性提高了29.62%，热稳定性提高了82.31%。本发明专利技术得到的BSNK-T160菌株可用于生产高活、热稳定性纳豆激酶。用该新菌株发酵大豆24h便可产出纳豆，且所得纳豆品质优良。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物领域，特别是涉及一种新的高活、热稳定性纳豆激酶生产菌株及其在发酵生产纳豆及纳豆激酶方面的应用，本专利技术还涉及该菌株产生的发酵制品。
技术介绍
纳豆激酶(nattokinase,NK)是由纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus natto)分泌表达的高效纤维蛋白溶解酶，最早从传统的日本大豆发酵产品纳豆中发现。与临床应用的溶栓药物相比，具有溶纤活性高、安全可靠、无毒副作用、半衰期长、在胃肠道中稳定性好，生产成本低廉等优点。尽管国内外学者从不同的大豆发酵产品中分离和筛选出了一些高产纳豆激酶菌 株，并进行了优化发酵条件以提高纳豆激酶的产量、异源表达提高纳豆激酶的纯度、通过菌种选育提高纳豆激酶的活力等研究，但对提高纳豆激酶热稳定方面的研究鲜有报道。实践中真正可用于产业化生产纳豆激酶的菌株很少。特别是，由于纳豆激酶对热不稳定，一直是限制该酶在保健食品、医药领域应用的瓶颈。因此，得到高活性和热稳定性的纳豆激酶菌株需求十分迫切。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供新的高活、热稳定性纳豆激酶生产菌；本专利技术的直接目的是筛选出一种新的纳豆枯草芽孢杆菌，使其可用于较大量生产纳豆及高活、热稳定性纳豆激酶。本专利技术人通过800Gy6°Co- Y射线辐照诱变纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-5，采用酪蛋白平板法经过多次点板传代反复筛选，结合65°C处理得到了高活、热稳定性突变菌株一纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus natto)BSNK_T160,该新菌株已于2012年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6714。本专利技术所述的纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160特征为形态特征菌株的菌落在LB平板上呈圆形，直径2_4mm，乳白色，不透明，边缘不整齐，表面干燥，有皱褶，用接种环挑菌落有拉丝现象，菌落与培养基不结合，菌落正反面颜色相同。显微镜下个体形态观察，菌株杆状，长3-4 μ m，宽O. 8-1 μ m,两端钝圆，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生，见图I和图2。培养特征BSNK-T160生长所用的培养基为LB培养基，辐照诱变所用的筛选培养基为酪蛋白培养基，培养温度为30-37°C。所述酪蛋白培养基的配方为酪蛋白1%、酵母提取物O. 5%、NaCl O. 9%、琼脂2%，ρΗ7· 2-7. 4，121°C 灭菌 20min，现用现配。本专利技术固体发酵所用的培养基为大豆，发酵温度为38_40°C。由纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160发酵产生的发酵制品也属于本专利的的保护范围。所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所述发酵制品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状等流体外形。专利技术效果经酪蛋白平板法筛选，纤维蛋白平板法检测筛选菌株的纤维蛋白溶解活性和热稳定性，固体发酵验证菌体的发酵能力等实验证实与野生型菌株BSNK-5相比，突变菌株BSNK-T160具有以下有益效果I、提高了酪蛋白水解活性和热稳定性在37°C的酪蛋白水解活性提高了 46. 9%，65°C热稳定性提高约8倍(图3)2、提高了纤维蛋白溶解活性，特别是在65°C高温下的活性·纤维蛋白平板检测结果表明BSNK-T160在37°C的溶解圈面积增加了 20. 93%，相对于尿激酶的活性提高了 29. 62% ;65°C热处理后溶解圈面积增加了 32. 13%，相对于尿激酶的活性提高了 82.31% (图4)。3、由纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160发酵产生的发酵制品质量好固态发酵实验进一步证实接种BSNK-T160菌株24h后便在大豆表面形成一层白膜，呈粘性，拉丝较长，所得纳豆颜色发黄，有金属光泽，具有酱香味(图5)。本专利技术的BSNK-T160的优点如下I、较高的纤维蛋白水解活性；2、较好的热稳定性；3、发酵速度快，24小时就可发酵大豆产纳豆,大于市场纳豆菌发酵产纳豆最少需要 48h。4、发酵所得纳豆品质好，没有氨臭味，具有酱香味。因此，BSNK-T160菌株是理想的研究、应用的出发材料菌株。在纳豆激酶及纳豆的生产领域中具有实现其产业化的极大可能，并具有广阔的医药、食品应用和市场前景。附图说明图I为纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160的菌落形态图；图2为纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160的菌体形态图；图3为不同温度处理后BSNK-T160的酪蛋白水解活性图；图4为不同温度处理后BSNK-T160相对于尿激酶的活性图；图5为BSNK-T160固体发酵产纳豆图。生物材料保藏信息名称纳豆枯草芽抱杆菌(Bacillussutilis natto) BSNK-T160保藏编号CGMCCNo. 6714保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏时间2012年10月29日。具体实施例方式以下实施例仅用于举例说明本专利技术的方法，并不限制本专利技术的范围。 实施例I高活热稳定性突变菌株BSNK-T160筛选I.材料I. I 菌种BSNK-5,由专利技术人实验室从我国黑豆豆豉分离、筛选和鉴定的纳豆枯草芽孢杆菌。I. 2培养基种子和液体发酵培养基LB培养基；筛选培养基酪蛋白平板培养基。I. 3活力测定方法酪蛋白平板法将平板(9cmX 9cm)放在水平仪上调水平，用IOmM pH7. 2PBS溶液配制1%的琼脂糖，微波炉加热使之融化，加入pH8. OTris-HCl缓冲液配制的等体积酪蛋白溶液，使终浓度为3mg/ml，趁热倒入平板中，将气泡赶至边缘，室温下凝固。用直径5_的打孔器打孔，将待测样品点入孔内，37°C保温18h，小心取出平板，考马斯亮蓝染色，7%冰乙酸脱色，酪蛋白被水解后，点样孔周围显示透明圈，其余部位为蓝色。2 方法2. I菌悬液制备从活化好的BSNK-5平板接单菌落到20ml LB液体培养基，30°C培养大约8_10h，到0D600为O. 8-1. 0，取出，离心收集菌体(6000rpm，5min)，生理盐水清洗2次，用等体积生理盐水溶解，备用。2. 2 60Co- Y射线辐照诱变取Iml上述菌液，加入9ml生理盐水，SOOGy进行辐照诱变。将辐照诱变菌液进行倍比稀释，取100 μ I涂酪蛋白平板，每个梯度涂10个酪蛋白平板，30°C过夜培养。2. 3高活菌株筛选高活菌株初筛随机选取照射后生长菌株点酪蛋白平板，以未经照射菌株为对照，30°C过夜培养。次日取出，选取正突变株(即酪蛋白平板溶解圈直径与菌落直径比值比对照菌株溶解圈直径与菌落直径比值增大10%的菌株)，重复点酪蛋白平板多次，进行溶解圈观察。高活菌株复筛将最终确认稳定菌株经3ml LB液体培养基、30°C、220rpm培养5h，取发酵液10 μ I点酪蛋白平板，30°C培养18h，计算溶解圈面积，选取诱变菌株溶解圈面积比对照菌溶解圈面积增大10%的菌株进行热稳定性分析。2. 4热稳定性菌株筛选将筛选菌株发酵液经37、55、60和65°C处理15min，酪蛋白平板检测活性，将热处理后溶解圈面积比对照菌株大的菌株作为正突变菌株。3 结果利用SOOGy6ciCo- Y辐照BSNK-5菌株，结合热处理，酪蛋白平板法筛菌得到活性和热稳定提高菌株BSNK-T160(菌落与菌体形态见图I和2)。野生型菌株BSNK-5在37°C的本文档来自技高网...
【技术保护点】
纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus?natto）BSNK?T160，CGMCC?No.6714。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐选明，李淑英，聂莹，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：
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