一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳的制备方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵红芸豆汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳。本发明专利技术得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳中，吡咯喹啉醌含量达到121-245ng/mL，纳豆激酶活力达到1103-1819U/mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物工程与发酵领域，具体涉及一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的 红芸豆乳的制备方法。
技术介绍
纳豆由大豆经纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)发酵而成，具有多重生理功效： ①纳豆对心血管系统的作用：纳豆中一种标志性生理活性物质纳豆激酶 (Nattokinase，NK)是能够溶解血栓的蛋白质，由275个氨基酸残基组成，分子量27KD左右， 无毒、无副作用，是一种丝氨酸蛋白酶，其溶栓效果甚至超过溶栓制剂尿激酶。纳豆激酶除 具有直接溶栓作用外，还具有促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂的能力，从而 间接表现其溶栓活性。纳豆中亚油酸占全脂质的50%，亚油酸能够降低血浆中胆固醇含量， 有预防动脉硬化、心脏病和高血压的功效，具有血栓溶解作用； ②纳豆对消化系统的作用：大豆蛋白质经纳豆酶的作用转化成可溶性多肽和氨 基酸，有利于人体吸收。Ig纳豆中含有10亿个以上纳豆菌，纳豆菌繁殖快，能消耗肠道中 的氧，可以抑制引起肠内异常发酵的痢疾杆菌等腐败菌，促进乳酸菌繁殖，调节肠内细菌平 衡，预防痢疾、肠炎和便秘等。大豆经过纳豆菌发酵蓄积了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯 酶、纤维素酶和脲酶等酶群，这些生物酶在消化系统中能够有效调理促进消化吸收。纳豆芽 孢杆菌在通过分解利用大豆蛋白进行繁殖的过程中，可以产生大量酵素、维生素、多聚谷氨 酸和多聚果糖等粘性物质，其被覆在胃肠粘膜表面起到保护作用，饮酒时可缓解酒醉。纳豆 菌还能杀死肠道出血性大肠杆菌； ③纳豆对免疫系统的作用：通过接种纳豆菌的动物实验发现，纳豆可以提高机体 抵抗力，排除侵入的葡萄球菌，还可以诱发机体干扰素生成，增强机体免疫力；纳豆中含有 活性物质如皂草甙、维生素 B2、维生素 E等，每天食用可除去体内致癌物质，预防癌症发生， 并可软化血管，促进肌肤光滑； ④促进骨骼发育：维生素K2可促进钙与蛋白质结合从而促进骨骼形成，在骨骼形 成过程中起着重要作用，而纳豆中维生素 K2含量是其他发酵食品的数百倍，有预防骨质疏 松、腰痛等老年病的功效。 近年发现纳豆还具有其它更丰富广泛的生理功效，源于其另一种标志性生理活性 物质-批咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ)，它是继黄素核苷酸和烟酰胺核苷 酸之后在细菌脱氢酶中发现的第三种辅基，化学名称为4, 5-二氢-4, 5-二氧化-1-氢吡咯 (2, 3f)醌-2, 7, 9-三羧酸，又名Methaxatin。虽然自然条件下仅少数细菌如Methylovorus、 Deinococcus radiodurans>Gluconobacter oxydans、Klebsiella pneumoniae 等會泛够合成 PQQ，但在各种植物、动物以及人体内都发现含有微量PQQ。日本科学家测定了 26种常见食 物中的PQQ含量，发现1克食物中PQQ含量在3. 65-61纳克不等，例如，蔬菜中的欧芹、青椒， 水果中的奇异果、木瓜，饮品中的绿茶、乌龙茶，以及人们常吃的豆腐。值得注意的是，日本 传统食物纳豆当中PQQ含量最高，达到61纳克/克。 PQQ作为一种普遍存在于动物和植物组织中的氧化还原酶辅基，虽然含量非常低， 但作用重要，不仅是一种新发现的线粒体呼吸链组分，参与催化生物体内氧化还原反应，还 具有非常多样的生物活性，缺乏时会引起哺乳动物诸多代谢障碍，被认为是一种新型维生 素。PQQ对哺乳动物的主要生理作用有： ①全面提高人体免疫功能：PQQ作为人类发育的必要因子，能刺激人体细胞生长， 尤其是激活人体B细胞、T细胞，提高人体免疫功能； ②防治肝损伤：PQQ能显著降低血清胆红素和谷丙转氨酶水平，调理肝损伤，对肝 脏疾病有极好疗效； ③减少自由基对人体的伤害：PQQ是一种氧化还原酶辅基，参与生物体内氧化还 原反应，能有效清除体内自由基，减少自由基对人体伤害所引发的各种疾病，如心脏病、癌 症以及各类炎症； ④调理各种神经系统疾病：PQQ在体内能促进神经因子合成，调理各种神经系统 疾病； ⑤促进氨基酸吸收：PQQ是醌蛋白酶的辅基，参与呼吸链电子传递，在人体内能促 进氨基酸吸收； ⑥促进生长因子合成：生长因子是人类生长的激素，PQQ能刺激人体细胞生长，增 加细胞密度，微量PQQ就能提高生物体组织的代谢能力和生长机能； ⑦防治老年痴呆症：PQQ具有修复神经纤维、活化神经元、激活休眠神经细胞的能 力，能有效防治老年痴呆症和改善记忆力； ⑧促进谷胱甘肽合成：谷胱甘肽具有重要抗氧化作用和整合解毒作用，PQQ能促 进机体谷胱甘肽合成，防止白内障发生和肝脏胆红素积累； ⑨极强的抗癌功能：PQQ激活自然杀伤细胞（NK)细胞为ANK细胞，使其具有杀肿 瘤作用；使NK细胞等免疫细胞聚集，更有效地杀灭肿瘤细胞；封闭肿瘤细胞载铁蛋白受体， 阻断其功能，抑制肿瘤生长、转移；破坏肿瘤细胞脂质双层，使肿瘤细胞溶解死亡；阻止肿 瘤细胞DNA复制，促其凋亡。 在天然食品中，纳豆独有NK，并且PQQ含量最丰富。纳豆中的NK和PQQ由纳豆芽 孢杆菌产生。纳豆是日常健康食品，纳豆芽孢杆菌是公认安全的食品级微生物（GRAS微生 物），对纳豆芽孢杆菌进行定向选育，然后与乳酸菌共发酵，制备富含NK和PQQ的食品，对于 人们在日常饮食中补充NK和PQQ、充分发挥NK和PQQ的生理调理作用具有重要意义。 红芸豆中富含花色苷和皂苷，有明显抗炎作用，对关节炎患者可起到消炎、缓解疼 痛的功效。红芸豆还是高钾低钠食品，很适合心脏病、动脉硬化、高血脂和忌盐患者食用。红 芸豆乳是用浸泡后的红芸豆高温研磨加工而成的饮品，保留了红芸豆营养成分，经乳酸菌 发酵后，将进一步形成乳酸菌素、活性脂肪酸、以乳酸为主的有机酸等诸多食疗物质。 乳酸菌发酵除能产生诸多食疗成分外，还能赋予怡人的甜酸口感。纳豆芽孢杆菌 发酵则能产生NK和PQQ。本专利技术通过选育纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌及其共发酵，开发出 富含NK和PQQ的食疗发酵红芸豆乳。但如果干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌在同一体系中生 长不平衡会导致一种菌在竞争中排斥另一种，共发酵无法顺利进行。关于生理特性，即使在 野生状态下，乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少数菌株具有且活力不高，分解蛋白质获得必 需氨基酸的能力不足，而纳豆芽孢杆菌具有较强蛋白酶活力，其分解蛋白质产生氨基酸和 肽可满足乳酸菌对氨基酸的需求。纳豆芽孢杆菌兼性厌氧，通过消耗氧气也促进乳酸菌生 长和产酸。在本专利技术中，除了纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌两者之间存在不严格偏利共生关 系外，更通过选育手段使干酪乳杆菌因形成甲硫氨酸营养缺陷（MetO而与纳豆芽孢杆菌形 成严格偏利共生关系，从而保证了干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌的共发酵顺利进行。 纳豆芽孢杆菌合成NK和PQQ的代谢途径迄今尚未完全明了，从而无法通过理性优 化手段提高纳豆芽孢杆菌合成NK和PQQ的产率。而且由于糖、氨基酸、脂类、核苷酸四大有 机物代谢之间的相通和密切关联，使得微生物细胞代谢网络既显示出刚性（Rigidity)又 显示出柔性（Plasticity)，处于严格控制之中，刚性表现为牵一发而动全身，从而在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN‑NKPQQ‑RWX‑206；2)、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS‑Met‑；3)将纳豆芽孢杆菌BN‑NKPQQ‑RWX‑206和干酪乳杆菌LcS‑Met‑共发酵红芸豆汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳。

【技术特征摘要】
1. 一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进 行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳 豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-206 ; 2) 、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌， 命名为干酪乳杆菌LcS-Met_ ; 3) 将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-206和干酪乳杆菌LcS-Mef共发酵红芸豆汁，得到 富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳。2. 根据权利要求1所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳的制备方法，其特征 在于，步骤1)中，所述的高通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁红芸豆汁固体培养 基，其中一个将小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白 配入，形成平板B ;②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其 中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板 A中，高产吡咯喹啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小 可肉眼判断产吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形 成透明圈，根据透明圈直径大小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高 产吡咯喹啉醌菌落与高产纳豆激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌 的纳豆芽孢杆菌。3. 根据权利要求2所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳的制备方法，其特征 在于，步骤1)中，所述的平板豆芽汁红芸豆汁固体培养基以IL计，由以下量的组分组成：4. 根据权利要求1所述的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的红芸豆乳的制备方法，其特征 在于，步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备 2个平板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸配入，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养 基平板，为平板D ;②将诱变后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另 一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现 菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨 酸营养缺陷型干酪乳杆菌。5. 根...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐娟，吴渊，邓惟，
申请(专利权)人：杭州元佩特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33