本发明专利技术公开了一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵工艺。菌种的拉丁学名是：Bacillus?coagulans，参据的菌株为：NJYHHWG?877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC?No.6681；本发明专利技术所提供的工艺主要以pH值与葡萄糖浓度为指导，分阶段调控不同底物的浓度以实现反馈补料培养，以大幅提高了发酵单位及生产产量，该发明专利技术操作方便简洁，有利于工业化生产，为益生菌的大规模生产、推广提供可借鉴模板。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于发酵工程
，涉及一种凝结芽孢杆菌及其反馈补料发酵实现高密度培养的生产工艺。
技术介绍
凝结芽孢杆菌在自然界分布广泛，其芽孢对热及其他致死因子有较强的抵抗能力，对抗菌素及其他化学药品的抗性也高。正是由于这个特性再加上有益凝结芽孢杆菌具有分泌各种蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶(S0D)、抗菌素及多种氨基酸、维生素等营养物质的能力，因此可以被广泛应用于医药保健、农业和食品等各领域。凝结芽孢杆菌是芽孢杆菌中极具应用潜力的菌种之一，其抑菌效果显著。该菌主要特征与普通乳酸菌十分相似，口服后可在盲肠、结肠内定植，在大肠中进行发酵，且在发酵过程中，可产生短链脂肪酸，如乳酸和醋酸等；凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，能适应低氧的肠道环境，进入肠道后会消耗游离氧并繁殖，有利于厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长；该菌对酸和胆汁有高耐性，能够进行乳酸发酵，产生的L 乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌；由于能够形成芽孢，所以较之不产乳酸的芽孢杆菌更益于恢复胃肠道微生态平衡。从而促进肠道微生态平衡，提高机体免疫和抗病能力，预防肠道疾病。凝结芽孢杆菌对多种植物病原菌有很强的抑制作用，也可作为农业增产物质使用。Bacillus coagulans CGMCCNo. 6681经田间抑菌及生防试验还发现其对瓜、果、蔬菜等经济作物的灰霉病、纹枯病、白粉病、黑斑病等多种作物病害都具有显著的防治效果。在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养等中下游技术是我国最薄弱的技术环节，本专利技术针对凝结芽孢杆菌产业化过程中遇到的瓶颈问题进行深入研究，并对细胞大规模培养的工业化发酵工艺进行探索，以降低凝结芽孢杆菌的生产成本，为生物农药的大规模生产、推广提供可借鉴模板。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提高凝结芽孢杆菌发酵单位及生产产量，为益生菌的大规模生产、推广而提供了一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵工艺；主要是通过反馈补料发酵方法来实现高密度发酵。本专利技术的技术方案为一种芽孢杆菌，其分类命名为凝结芽孢杆菌菌株，菌种的拉丁学名是Bacillus coagulans，参据的菌株为NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No. 6681。本专利技术还提供了一种利用上述凝结芽孢杆菌进行高密度发酵的工艺，其具体步骤如下从营养琼脂培养基挑取凝结芽孢杆菌菌体，接入种子液培养基摇瓶培养得发酵种子液；取发酵培养基体积的4 20%的发酵种子液接入灭菌后装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；通过反馈补料法控制营养物质的浓度进行高密度发酵，控制温度、通气量和转速，发酵培养48 78h得发酵液。上述的培养发酵种子液是从35 42°C培养50 72h后的营养琼脂培养基上挑取菌体，接入装有种子液培养基的无菌锥形瓶中，35 42°C条件下摇床培养，控制转速140 200rpm，32 48h后得发酵种子液；其中锥形瓶中装的种子液培养基量为锥形瓶体积的5 25%。优选所述的种子液培养基组分为蛋白胨8 15g/L,酵母膏3 8g/L, NaC14 8g/L,葡萄糖35 70g/L，pH控制在6. 5 7. 8。优选发酵培养基组分蛋白胨8 15g/L,酵母膏3 8g/L, NaCl 4 8g/L,葡萄糖 35 70g/L, CaCO3 10 15g/L, K2HPO4 O. 8 I. 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. I O. 6g/L,ZnSO4 · 7H20 O. 005 O. 015g/L, MnCl2 · 4H20 0· 001 O. 005g/L, pH 保持在 6· 5 7· 8 ;发酵罐装液量为发酵罐体积的20 45%。 优选所述的反馈补料为分阶段进行补料流加，发酵进行16 26h开始流加底物A，并以发酵液中PH值来指导底物流加速度，使pH值保持在6. 5 7. 8 ;在发酵进行12 24h开始，流加底物B，并以葡萄糖的浓度来指导底物流加速度，使发酵罐内葡萄糖内浓度控制在 50 70g/L，发酵 32 44h ;其中底物 A成份为CaC0355 85g/L，(NH4) 2HP0450 80g/L ；底物 B 成份为葡萄糖 200 400g/L，酵母膏 50 80g/L，Κ2ΗΡ044· 5 8. 5g/L, MgSO4 ·7Η20O. 57 3. 5g/L。优选发酵培养过程中控制温度在36 42°C;通入无菌空气，保持通气量在3 6L/(L · min)以控制溶氧在30 45% ;控制转速在140 200rpm。CGMCC No. 6681菌株具有下述性质I、形态与培养特征该菌为革兰氏染色阳性菌，菌体呈杆形，(O. 8 I) μ mX (3 4)μπι，单个或成短链。产生卵圆形芽孢，大多偏菌体一端菌，有的孢子囊膨胀，有运动性。对外界环境抵抗力很强，90°C处理lOmin，100°C处理5min不会失活，pH值为4. O 9. O时也能生长。在营养琼脂培养基上边缘不整齐，呈扁平圆形白色菌落，2 3mm大小。兼性厌氧菌，生长温度为20 55°C，最适生长温度为35 45°C。2、生理生化特性凝结芽孢杆菌CGMCC No. 6681菌株的主要生理生化特征见表I :表I菌株的生理生化特征权利要求1.一种芽孢杆菌，其分类命名为凝结芽孢杆菌菌株，菌种的拉丁学名是=BacillUScoagulans，参据的菌株为NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No. 6681。2.一种利用如权利要求I所述的凝结芽孢杆菌进行高密度发酵的工艺，其具体步骤如下从营养琼脂培养基挑取凝结芽孢杆菌菌体，接入种子液培养基摇瓶培养得发酵种子液；取发酵培养基体积的4 20%的发酵种子液接入灭菌后装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养；通过反馈补料法控制营养物质的浓度进行高密度发酵，控制温度、通气量和转速，发酵培养48 78h得发酵液。3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于培养发酵种子液是从35 42°C培养50 72h后的营养琼脂培养基上挑取菌体，接入装有种子液培养基的无菌锥形瓶中，35 42°C条件下摇床培养，控制转速140 200rpm, 32 48h后得发酵种子液；其中锥形瓶中装的种子液培养基量为锥形瓶体积的5 25%。4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于所述的种子液培养基组分为蛋白胨8 15g/L,酵母膏3 8g/L, NaCl 4 8g/L,葡萄糖35 70g/L, pH控制在6. 5 7. 8。5.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于发酵培养基组分蛋白胨8 15g/L，酵母膏 3 8g/L, NaCl 4 8g/L,葡萄糖 35 70g/L, CaCO3IO 15g/L, K2HPO4O. 8 I. 5g/L,MgSO4 · 7H20 O. I O. 6g/L, ZnSO4 · 7H20 O. 005 O. 015g/L, MnCl2 · 4H20 0· 001 O. 005g/L，pH保持在6. 5 7. 8 ;发酵罐装液量为发酵罐体积的20 45%。6.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于所述的反馈补料为分阶段进行补料本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种芽孢杆菌，其分类命名为凝结芽孢杆菌菌株，菌种的拉丁学名是：Bacillus?coagulans，参据的菌株为：NJYHHWG?877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC?No.6681。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡永红，杨文革，唐容容，钱永根，王济奎，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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