本发明专利技术属生物技术领域，具体涉及一种利用肿瘤靶向性细菌激活前药的方法及其应用，该方法利用肿瘤靶向性细菌作为一种天然的前药激活工具，肿瘤靶向性细菌能够组成型地表达内源性的前药激活酶基因，从而能够在肿瘤组织特异性地激活前药，产生抗肿瘤效果，该方法能够用于肿瘤的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，具体涉及一种利用肿瘤靶向性细菌激活前药的方法及其应用。
技术介绍
特异性地杀伤肿瘤细胞而避免伤害机体正常细胞的肿瘤靶向治疗一直是肿瘤治疗研究的一个重要方向和热点。基因介导的酶前药治疗(Gene-Directed Enzyme ProdrugTherapy, GDEPT)做为肿瘤靶向性治疗的一种重要手段在多种肿瘤动物模型或临床上显示了良好的治疗效率。目前已开发的酶/前药治疗系统主要有单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)、嘌呤核苷酸磷酸酶/6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷(PNP/6MePdR)等等。这些可用于激活前药的酶主要来自于细菌或病毒，而不表达于正常哺乳动物细胞。人们利用病毒载体、细菌载体、抗体将激活前药的酶特 异性运输到肿瘤组织，使前药激活酶在肿瘤细胞或组织中特异性表达，这样注射前药以后，前药就特异性地在肿瘤组织内转化为有杀伤活性的药，而避免对正常机体的伤害(Xu G等，2001，Clin Cancer Res. 7(11) :3314-3324)。但是依赖于表达载体的GDEPT治疗存在以下缺点肿瘤靶向性不佳、肿瘤细胞转染效率不足、体内稳定性不好、造价昂贵等。嘌呤核苷酸磷酸酶/6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷(PNP/6MePdR)系统是由Sorscher EJ等于1994年开发，它利用大肠杆菌PNP基因(嘌呤核苷酸磷酸酶)可以转化腺苷(脱氧腺苷)为腺嘌呤和核糖一磷酸(脱氧核糖一磷酸)，而正常哺乳动物细胞的嘌呤核苷酸磷酸酶没有该活性，不能催化腺苷(脱氧腺苷)的裂解(Sorscher EJ等，1994年，Gene Ther 1:233-238)。PNP/6MePdR系统具有广谱的抗肿瘤效果，学者们利用各种靶向性载体试图实现PNP基因在肿瘤高效靶向的表达，但是仍然面临着上述依赖于载体的酶前药治疗的各种技术难题。一些兼性厌氧细菌如沙门氏菌、梭状芽孢杆菌等能够特异性的在肿瘤坏死区复制、生长、代谢和繁殖，具有较高的肿瘤靶向性。这些细菌加以减毒改造后，被广泛的用于肿瘤治疗或肿瘤基因治疗的运输载体。2002年美国I期临床显示单一剂量的静脉注射减毒沙门氏菌没有显示良好的抗肿瘤效果(Toso JF等，2002，J Clin Oncol 20 :142-152.)，因此单一的肿瘤细菌治疗仍然存在着疗效不显著等问题，急需开发一种新的策略和系统以增强肿瘤细菌治疗的疗效，减少副作用。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对以上存在的问题和不足，解决上述前药和细菌治疗中存在的各种技术难题，建立实现在肿瘤组织中高效特异性地富集前药激活酶，开发一种具有良好的治疗效率，且操作简单，成本低廉的肿瘤靶向性细菌/前药激活方法。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种利用肿瘤靶向性细菌激活前药的方法，其特征是将肿瘤靶向性细菌作为一种天然的前药激活工具，所述的肿瘤靶向性细菌可以为减毒鼠伤寒沙门氏菌或其它具有肿瘤靶向性能的细菌；所述的前药可以为6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷^MePdR)或其他可以被细菌转化为活性抗肿瘤药的化合物。进一步地，本专利技术提供了一种本身具有前药激活活性的肿瘤靶向性细菌，其特征是不经过任何基因改造或外源基因的过表达，而是利用细菌自身内源性的组成性表达于细菌胞内、周质、内膜或外膜的具有前药转化活性的酶来实现对前药的激活。进一步地， 本专利技术提供了一种由细菌自身表达的细菌前药激活酶基因，其特征是不经过任何基因改造或外源基因的过表达，而是利用细菌自身内源性的组成性表达于细菌内、来实现前药的转化和激活。该类细菌前药激活酶基因在细菌中高度保守，该类可以是嘌呤核苷酸磷酸酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、胸苷激酶基因。进一步地，本专利技术提供了一种细菌介导的前药激活方法，其特征在于将细菌作为前药转化的工具，而且所述的细菌还必须具有好的肿瘤靶向能力。进一步地，本专利技术提供了一种前药激活方法，其特征是利用细菌自身的前药激活酶基因作为前药的转化工作，该类前药可以是丙氧鸟苷(GCV)、5_氟胞嘧啶(5-FC)、6_甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷^MePdR)。进一步地，以减毒鼠伤寒沙门氏菌激活6-甲基嘌呤-2-脱氧核糖核苷^MePdR)前药为例，减毒鼠伤寒沙门氏菌可以将前药6MePdR转化为高效的抗肿瘤药6-甲基嘌呤(6MeP)，在小鼠黑色素瘤模型中，肿瘤倍数生长时间由6MePdR组的5. 54天，细菌组的8. 72天，增加到6MePdR/细菌组的19. 58天。与现有的前药激活方法或细菌治疗策略相比，本专利技术的创新和特殊之处在于(I)专利技术了一种肿瘤靶向性细菌/前药激活方法，其利用肿瘤靶向性细菌及其自身内源的前药激活基因来激活前药，并在小鼠黑色素瘤模型上，细菌/前药组肿瘤抑制率显著高于单一的细菌组和单一的前药给药组。(2)专利技术了一种前药细菌激活方式，该方式直接利用细菌来转化前药，利用该方式可以实现在肿瘤组织特异性地激活前药。(3)专利技术了一种细菌/前药联合应用的治疗策略，利用该策略可以大大提高细菌抗肿瘤效率。综上所述，本专利技术建立了一种全新的肿瘤治疗方法，该方法将肿瘤靶向性细菌与前药联合，利用富集于肿瘤组织的细菌直接激活前药，而不需要在细菌中引入或者过表达外源性的前药激活基因，获得良好的治疗效果。四附图说明图I、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009肿瘤靶向性分析由于肝脏和脾脏是细菌分布最多的正常组织，因此检测细菌在肝脏、脾脏和肿瘤组织中的滴度(***P < O. 001) :I、肿瘤；2、脾脏；3、肝脏。图2、减毒鼠伤寒沙门氏菌前药激活活性分析(2A)鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌PNP基因序列分析与同源性比较。(2B)PNP基因在鼠伤寒沙门氏菌VNP20009和大肠杆菌ToplO中的表达1、鼠伤寒沙门氏菌VNP20009 ;2、大肠杆菌ToplO。(2C)注射细菌后，PNP基因在各组织中的表达I、脾脏；2、肝脏；3、肿瘤；4、肺；5、肾脏。图3、减毒鼠伤寒沙门氏菌激活前药分析HPLC分析鼠伤寒沙门氏菌VNP20009和大肠杆菌ToplO的前药激活活性1、前药底物 6MePdR标准品；2、活性产物 6MeP 标准品；3、ToplO+6MePdR ;4、VNP20009+6MePdR ;5、大肠杆菌ToplO ;6、鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。图4、细菌/前药抗肿瘤效率分析(4A)给药2周后，肿瘤大小I、PBS对照；2、前药6MePdR ;3、鼠伤寒沙门氏菌VNP20009 ;4、鼠伤寒沙门氏菌VNP20009+前药6MePdR。(4B)肿瘤生长曲线(**P < O. 01，***P < O. 001) :1、PBS 对照；2、前药 6MePdR ;3、鼠伤寒沙门氏菌VNP20009 ;4、鼠伤寒沙门氏菌VNP20009+前药6MePdR。·(4C)肿瘤倍数生长时间，即从IOOOmm3到2000mm3所需要的天数(*P < O. 05，***P<O. 001) :1、PBS对照;2、前药6MePdR;3、鼠伤寒沙门氏菌VNP20009 ;4、鼠伤寒沙门氏菌VNP20009+ 前药 6MePdR。(4D)肿瘤延迟时间，即肿瘤长到IOOOmm3所需要的天数0*P 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用肿瘤靶向性细菌激活前药的方法，其特征是将肿瘤靶向性细菌作为一种天然的前药激活工具，所述的肿瘤靶向性细菌是具有肿瘤靶向性能的细菌；所述的前药为被前药激活酶转化为抗肿瘤活性药的化合物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，陈果，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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