本发明专利技术涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是氨基脲（呋喃西林代谢物）衍生物的单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明专利技术的氨基脲衍生物单克隆抗体9B10’是由小鼠杂交瘤细胞株9B10产生，其亚型是IgG1型。本发明专利技术的有益效果是：通过小鼠杂交瘤细胞株9B10产生的单克隆抗体9B10’，能够大量生产，可用于制备检测氨基脲残留的酶联免疫分析试剂盒和胶体金试纸条，达到快速且灵敏地检测蜂蜜及动物组织中氨基脲残留的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是氨基脲衍生物的单克隆抗体及其应用，属于免疫化学
技术介绍
呋喃西林(nitrofurazone)属于硝基呋喃类药物,是一种广谱抗菌药，因价格低廉、效果好，被作为治疗药物和饲料添加剂用于畜、禽、水产养殖中控制疾病。呋喃西林分子中的药效基团一硝基是其作为药理作用及毒性产生的主要原因，同时也使得呋喃西林具有致畸、致癌性及诱发哺乳动物细胞染色体损伤等副作用。欧盟于1995年将呋喃西林列为禁用药。中国农业部2002年4月发布的第193号公告中，呋喃西林被列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中，在所有食品动物中禁用，2003年又将水产品中硝基呋喃代谢物纳入残留监控计划中。但由于呋喃西林具有很好的治疗及预防效果，目前仍在水产养殖、 畜、禽中被广泛使用，从而导致食品中呋喃西林残留日趋严峻。因此，为保护消费者健康，增强中国动物源性食品检疫力度、扩大贸易出口，对动物源性食品中氨基脲(SEM)残留的检测是非常必要的。呋喃西林原型药在动物体内很快代谢成氨基脲，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长的一段时间，被视为呋喃西林残留的标示物，所以通常通过分析其代谢产物SEM 来分析呋喃西林残留。目前用于呋喃西林残留标示物SEM的检测方法有液液萃取-高效液相色谱、固相萃取_高效液相色谱法(SPE-HPLC)、液相色谱质谱联用仪等方法。但这些仪器方法所需仪器价格昂贵，耗时长，对操作人员的要求较高，不适合在基层单位推广，不适合高通量的样品快速筛选。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术(ELISA)具有快速、 灵敏度高、操作简单、专一性好等优点，适合高通量的样品筛选。本研究将小分子药物氨基脲与对醛基苯甲酸进行衍生化实验，引入活性基团一羧基，并通过混合酸酐法将该衍生物与载体蛋白偶联获得人工合成的完全抗原，该法合成的完全抗原，通过交联臂对醛基苯甲酸的作用，可以将小分子药物氨基脲充分暴露出来，使机体更容易识别抗原决定簇，提高抗原的免疫原性。以制备的完全抗原免疫Balb/c鼠，通过融合筛选得到能够识别氨基脲衍生物的单克隆抗体，从而为呋喃西林代谢物残留检测的免疫学方法奠定基础。
技术实现思路
本专利技术要解决技术问题是针对以上现有技术存在的缺点，提出一种氨基脲衍生物的单克隆抗体，并将该单克隆抗体应用于检测呋喃西林代谢物。 该方法具有操作简便、成本低廉、高通量、特异性强的特点。本专利技术所涉及的杂交瘤细胞株9B10已于2011年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No. 5072，分类命名为抗氨基脲衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。由以上杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体命名为9B10’，其制备步骤如下a.制备免疫原和包被原采用对醛基苯甲酸法将载体蛋白(BSA)与氨基脲小分子偶联，合成免疫原和包被原；b.动物免疫注射以Balb/c鼠作为免疫动物，腹腔注射免疫原并加强免疫；c.筛选动物免疫血清用间接酶联免疫吸附法和竞争间接酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；d.制备杂交瘤细胞取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经过亚克隆获得可以稳定分泌抗氨基脲衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株9B10 ；e.制备并纯化单克隆抗体对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞9B10，采集腹水，对腹水进行液相层析纯化，获得氨基脲衍生物单克隆抗体9B10’。其中，步骤a所述载体蛋白为牛血清白蛋白和卵清白蛋白，对应的免疫原为 SEM-BSA，包被原为SEM-OVA ;所述对醛基苯甲酸法中，交联剂活化小分子衍生物的时间为 1-2小时，用氨基脲小分子衍生物与载体蛋白偶联反应10-15小时。所述步骤b中的各次免疫注射剂量为50-100 μ g/只。所述步骤e中对免疫小鼠腹腔进行单克隆抗体细胞株的注射量为(1-5) X IO6个/只。通过亚型鉴定得出本专利技术单克隆抗体的亚型为IgGl型。常规制备氨基脲衍生物单克隆抗体的方法主要是通过药物的羧基与载体蛋白的氨基偶联，本专利技术将氨基脲小分子通过对醛基苯甲酸进行衍生化并将衍生产物的羧基与载体蛋白的氨基偶联，从而暴露氨基脲的结构，在后期筛选过程中可以获得针氨基脲衍生物的抗体。本专利技术的再一个目的是提供该单克隆抗体在制备检测呋喃西林代谢物中的应用， 主要是将其应用于制备检测呋喃西林代谢物残留的ELISA试剂盒和胶体金试条纸。本专利技术的有益效果是通过小鼠杂交瘤细胞株9B10产生的单克隆抗体9B10’，该抗体与其它呋喃类药物交叉反应率低，能够大量生产，并可用于制备检测呋喃西林代谢物的酶联免疫分析法试剂盒和胶体金试纸条，达到快速、特异、且灵敏地检测蜂蜜及动物组织中的呋喃西林代谢物残留的目的，为检测呋喃西林代谢物残留的ELISA试剂盒、胶体金产品研制奠定基础。附图说明图I为本专利技术实施例一中免疫原的OD335标准曲线。图2为本专利技术实施例一中包被原的OD335标准曲线。具体实施方式实施例一试剂与材料准备呋喃西林(上海安谱科学仪器有限公司，C15571000)，SEM(上海安谱科学仪器有限公司，C16933500)，对醛基苯甲酸(Sigma 124 91-5)，DMF (sigma, D4551 )，牛血清白蛋白(BSA) (Jackson,001-000-173)，卵清白蛋白(OVA) (Sigma, A5503),弗氏完全佐剂(Sigma, F5881)，弗氏不完全佐剂(Sigma, F5506)，四甲基联苯胺(TMB)(Amresco, 0759)，HAT (Sigma, H0262)和 HT (Sigma, H0137)，氯化钠(Amresco, 0241)，氯化钾(Amresco, 0395),磷酸二氢钾(Sigma, P9791),磷酸氢二钠(Sigma, 71639),羊抗鼠 IgG-HRP (Jackson, 115-035-044)，二甲基亚砜(DMSO) (Applichem，0231)，聚乙二醇 4000 (PEG4000) (Sigma, P7306), DMEM 高糖培养基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco, C20270)。实验动物与细胞Balb/c小鼠(6-8周龄，雌性)，购自扬州大学动物中心，SP2/0 (小鼠骨髓瘤细胞)由中科院生物物理研究所感染与免疫研究中心唐捷教授惠赠。本专利技术的实验步骤如下a. 制备免疫原SEM-BSA和包被原SEM-OVA 本专利技术所述的人工抗原采用对醛基苯甲酸将氨基脲衍生化，并利用氨基脲衍生物上的羧基和载体蛋白上的氨基进行偶联，从而合成呋喃西林抗原。氨基脲衍生物结构式如下权利要求1.一种产生氨基脲衍生物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株9B10，是小鼠杂交瘤细胞系 CGMCC No. 5072。2.根据权利要求I所述杂交瘤细胞株9B10产生的单克隆抗体9B10’。3.根据权利要求2所述单克隆抗体9B10’，其特征在于所述单克隆抗体亚型为IgGl型。4.根据权利要求2所述单克隆抗体9B10’在检测氨基脲残留中的应用。全文摘要本专利技术涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是氨基脲(呋喃西林代谢物)衍生物的单克隆抗体及其应用，属于免疫化学
本专利技术的氨基脲衍生物单克隆抗体9B10’是由小鼠杂交瘤细胞株9B10产生，其亚型是IgG1型本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生氨基脲衍生物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株9B10，是小鼠杂交瘤细胞系CGMCC？No.5072。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐宏，崔迎利，王晓艳，
申请(专利权)人：泰州康正生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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