本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及抗原表位多肽的筛选与鉴定。本发明专利技术公开了一系列狂犬病毒糖蛋白与核蛋白抗原表位多肽的筛选、鉴定以及应用。通过生物信息学手段对狂犬病毒糖蛋白与核蛋白进行预测获得候选表位多肽，利用淋巴细胞增殖实验、ELISPOT实验以及流式细胞法对后续表位多肽进行体外实验验证，获得四条狂犬病毒蛋白的抗原表位多肽，其特征在于包含Th表位和CTL表位，并能够在体外刺激经疫苗免疫小鼠的淋巴细胞增殖，且诱导细胞分泌相关细胞因子，具有杀伤感染病毒的细胞以及刺激抗体产生的作用。本发明专利技术可用于狂犬病毒表位疫苗的开发和对疫苗功效的检测，对研制生产狂犬病疫苗的免疫功能检测试剂盒具有重要的价值。
【技术实现步骤摘要】
狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽及其筛选、鉴定方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种狂犬病毒糖蛋白与核蛋白抗原表位及其筛选、鉴定方法与应用。
技术介绍
狂犬病是当前威胁人类健康的一种比较严重的急性传染病，人类患者一旦被病畜咬伤而发病，死亡率闻达95%以上。狂犬病病毒属于弹状病毒科(rhabdoviridae),狂犬病病毒属(lyssa virus)，呈子弹状。狂犬病病毒可通过破损的皮肤或黏膜侵入人体， 经神经末梢上行进入人及所有温血动物中枢神经系统(CNS)而引发狂犬病。狂犬病病毒基因组核酸为不分节段的单股负链RNA，由11928或11932个核苷酸组成，相对分子量约4.6X106，3’到5’端依次排列着N、P、M、G、L基因，分别编码5种结构蛋白核蛋白 (nucleoprotein, NP)、憐酸化蛋白(phosphoprotein, PP)、基质蛋白(matrix protein, MP)、糖蛋白(glycoprotein,GP)和转录酶大蛋白(large protein, LP)。完整的狂犬病病毒颗粒由核衣壳和包膜两部分构成，核衣壳由核蛋白、磷蛋白和转录酶大蛋白构成，而包膜由糖蛋白和基质蛋白构成。当前我国狂犬病形势相当严峻，发病率居世界第二位，仅次于印度。通过注射狂犬病毒疫苗预防狂犬病的感染是当前控制狂犬病发病的重要途径。但是目前狂犬病毒疫苗的免疫效果在人群中存在较大差异，且注射后体内狂犬病毒抗体的滴度上升到具有保护效力的滴度所需要的时间较长，不足以在病毒潜伏期内产生足够的抗体以抵抗狂犬病毒的感染和发病。表位疫苗作为近年来新发展起来的一种新型疫苗技术，其含有能够被机体免疫细胞直接识别的MHC限制性多肽，能够激发机体产生广泛而强烈的细胞免疫与体液免疫反应，特别是针对T细胞表位设计的表位疫苗，能够产生具有细胞杀伤作用的CTL和促进中和抗体产生的Th免疫应答反应，对于清除病毒感染、提供免疫保护具有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种狂犬病毒的抗原表位多肽，并提供筛选和鉴定这种表位多肽的方法以及抗原表位多肽的应用。本专利技术涉及的一系列狂犬病毒抗原表位多肽，具体包含以下序列(1)狂犬病毒糖蛋白氨基酸序列第367 381的Th表位，记作G367_381，以及第333 341的 CTL 表位，记作 G333_341，分别如 SEQ. ID. NO. I 和 SEQ. ID. NO. 2 所示；(2)狂犬病毒核蛋白氨基酸序列第92 106的Th表位，记作N92_1Q6，以及第409 423的 CTL 表位，记作 N409^423,分别如 SEQ. ID. NO. 3 和 SEQ. ID. NO. 4 所示。本专利技术提供的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽，具有MHC限制性的特征，并且所述抗原为如下(a)或(b)所示的蛋白质(a)由SEQ. ID · NO. I、SEQ. ID · NO. 2、SEQ. ID · NO. 3 或 SEQ. ID · NO. 4 所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加f5个氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术还提供编码所述蛋白质(a)或(b)的基因，其具有(a)由SEQ. ID · NO. I、SEQ. ID · NO. 2、SEQ. ID · NO. 3 或 SEQ. ID · NO. 4 所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加f5个氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术还提供所述基因的原核表达载体。本专利技术还提供所述的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽，其由上述4条多肽以任意顺序直接连接或者通过连接肽连接而成。本专利技术提供的一系列狂犬病毒抗原表位多肽具有以下的功能特征①在淋巴细胞增殖实验中，可刺激经疫苗免疫的BALB/C小鼠脾细胞增殖，刺激指数SI > 2 ;②在 ELISP0T实验中，可刺激经疫苗免疫的BALB/c小鼠脾细胞分泌细胞因子IL-4和IFN-Y ； ③在流式细胞实验中，可诱导⑶3+⑶4+ T细胞和⑶3+⑶8+ T细胞分化。本专利技术公开的筛选和鉴定表位多肽的方法，具体步骤为(1)通过生物信息学软件BIMAS、SYFPEITHI以及RANKPEP对从NCBI获取的狂犬病毒糖蛋白与核蛋白序列进行预测分析，选择一定参数，选取结果中排名考前的序列作为候选表位序列；(2)合成候选表位序列，通过体外淋巴细胞增殖的实验对候选表位进行第一次筛选，选择刺激指数SI > 2的多肽进行下一步实验；(3)经过第一次筛选获得的多肽序列用ELISP0T实验和流式细胞法检测，检测指标主要是多肽刺激细胞因子IFN- Y和IL-4的分泌情况以及对⑶3+CD4+/⑶3+⑶8+T细胞亚群的影响情况；(4)通过对实验结果的分析，确定最后的表位多肽。本专利技术中的多肽可被抗原递呈细胞正确递呈，促进相关T细胞的激活，并且分泌细胞因子，具有激活细胞免疫应答的特性。由于细胞免疫反应对于清除机体感染的病毒发挥了关键的作用，因此，本专利技术可用于制备狂犬病毒的表位疫苗，及制备检测狂犬病毒的表位疫苗免疫效果的试剂盒。附图说明图I狂犬病毒糖蛋白与核蛋白CTL表位预测结果。图2狂犬病毒糖蛋白与核蛋白Th表位预测结果。具体实施方式一、狂犬病毒糖蛋白与和蛋白氨基酸序列的获得与表位的预测通过检索NCBI数据库，获得狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的氨基酸全长序列，编号分别为 gi_32440976 与 gi_294999043,具体序列如 SEQ. ID. NO. 5 和 SEQ. ID. NO. 6 显示。对 NCBI 数4据库中获得的狂犬病毒G蛋白与N蛋白的序列进行CTL表位以及Th表位的预测。小鼠的 MHC-I类分子包括H-2kd、H-2Dd和H_2Ld三个亚类，MHC-II类分子包括I-Ad和I-Ed两个亚类。因此为了获得CTL和Th表位，需要分别对这几个亚类进行分析与预测。对于MHC-I类分子，使用SYFPEITHI和BMAS软件进行预测，选择共同得分较高的6条序列，如表I所示。 对于MHC-II类分子，使用RANKPEP软件进行预测，选择得分较高的6条序列，如表2所示。二、表位多肽的合成与保存多肽合成由上海强耀生物科技有限公司完成，共计12条。多肽合成后经HPLC纯化， 纯度在90. 559Γ96. 65%之间。经质谱分析，合成的多肽实际相对分子质量与理论相符，说明合成的多肽正确，可用于后续鉴定实验。合成的多肽分别溶解于DMSO中，浓度为5mg/ ml, _80°C保存备用。三、小鼠分组与免疫将BALB/c小鼠随机分为两组，即实验组和对照组，每组12只。其中实验组腹腔注射O.5ml人用狂犬病疫苗(Vero细胞)，对照组注射相同剂量的生理盐水。各组小鼠均在第O 天和第七天各免疫一次,注射部位与剂量均相同。四、表位多肽淋巴细胞增殖实验小鼠末次免疫后IOd断头处死，无菌取脾后研磨过滤，用淋巴细胞分离液制成单细胞悬液，调整细胞浓度为IO6个/ml，加入96孔细胞培养板，100 μ I/孔，同时加入稀释好的多肽，终浓度为20 μ g/ml(每组5个平行孔，其中两孔用于流式细胞分析)。阴本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种狂犬病毒糖蛋白与核蛋白的抗原表位多肽，其特征在于具有MHC限制性的特征，并且所述抗原为如下(a)或？(b)所示的蛋白质：，(a)？由SEQ.ID？.NO.1、SEQ.ID？.NO.2、SEQ.ID？.NO.3或SEQ.ID？.NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)？在(a)中的氨基酸经过取代、缺失或添加1~5个氨基酸且具有狂犬病抗原表位活性的由(a)衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱乃硕，胡晓波，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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