家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。是先构建家蚕合成分泌狂犬病病毒糖蛋白RVGP的载体pBSer1RVGP-A3EGFP质粒和pBFibLRVGP-A3EGFP质粒，再利用显微注射转基因家蚕技术将这2种质粒分别与能够提供转座酶的辅助质粒一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使绿色荧光蛋白基因和狂犬病病毒糖蛋白基因导入到家蚕的基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制家蚕中部丝腺生物反应器、后部丝腺生物反应器、以及丝腺生物反应器三种生物反应器，育成家蚕中部丝腺细胞、后部丝腺细胞或两部分丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用转基因技术构建家蚕中部丝腺生物反应器、后部丝腺生物反应器、以及丝腺生物反应器三种生物反应器，使家蚕中部、后部、或中后两部分丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。
技术介绍
狂犬病是当今世界公共卫生中有严重威胁的传染病之一。狂犬病是由狂犬病病毒感染恒温动物或人引起，导致动物或者人急性致死性脑脊髓炎，临床特征主要表现为狂燥不安、行为反常、攻击性、进行性麻痹和最终死亡，是一种人兽共患传染病。其特点是潜伏期长，致死率高，几乎100%死亡。狂犬病病毒属于弹状病毒科弹状病毒属，是单链不分节负链RNA病毒，病毒外形呈弹状，一端纯圆，一端平凹，有囊膜，内含衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链 RNA。狂犬病病毒的基因组全长约12kb，基因组的3’端至5’端排列着N、P、M、G、L 5个结构基因，各基因序列的长度分别为1424、991、805、1675和6475bp，它们分别编码核蛋白 (N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L或RNA依赖的RNA转录酶蛋白)。狂犬病病毒有两种主要抗原一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，它能与乙酰胆碱受体结合，表现出神经毒性，能使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体；另一种为内层的核蛋白抗原，它使体内产生补体结合抗体和沉淀素。G蛋白是狂犬病病毒表面蛋白，可介导病毒的入侵，决定病毒的致病性和组织嗜性。G蛋白识别的宿主细胞表面受体包括烟碱型乙酰胆碱受体、神经细胞黏附因子和p75神经营养因子受体等。无G基因的狂犬病病毒不能经过突触传播。G蛋白分布到宿主细胞的表面可能导致离子通道紊乱，进而影响神经的生理功能，导致神经功能性损伤，是病毒引起机体病理变化的基础。G蛋白由524个氨基酸残基组成，相对分子质量为67Da，分为信号肽、膜外区、跨膜区和膜内区。G蛋白基因转录翻译后，在内质网上进行糖基化修饰，并切去 N端19个氨基酸残基信号肽后成为成熟的G蛋白，成熟后的糖蛋白具有505个氨基酸残基， 分为3个区域膜外区即抗原区(第1-439位)，位于病毒颗粒包膜的表面；穿膜区即跨膜区(第440-461位)，功能为把糖蛋白固定在病毒双脂膜上；膜内区(第462-505位)，位于病毒包膜内表面，提供M蛋白和N蛋白相互作用的位点。糖基化对于G蛋白正确的空间折叠、稳定性、加工运输、抗原性、免疫原性、致病性和毒力都有极其重要影响。不同毒株糖基化的数目、效率和位点不同，第319位Asn糖基化位点广泛存在于所有已知的多种狂犬病病毒，而第247位Asn的N糖苷能加强第319位Asn的糖基化，产生更多的寡甘露糖或高甘露糖型糖链，提高糖基化程度，提高了病毒对细胞的识别能力，进而影响到病毒的致病力。转基因家蚕中部丝腺生物反应器、后部丝腺生物反应器是在家蚕中部丝腺、后部丝腺中特异表达外源基因的转基因动物表达系统。家蚕生长周期短，50天左右可完成一个世代，每个雌蛾可产卵约400粒；家蚕经过长达四千多年的人工驯养、选育，性情温顺，已完CN 102286529 A说明书2/7页成丧失飞翔逃逸能力，而在丝蛋白合成、分泌方面具有非常强的能力；合成的蛋白可以随蚕丝蛋白一起分泌到体外，蚕丝蛋白主要由3种丝素蛋白和3种丝胶蛋白构成，成分简单。所以，转基因家蚕丝腺生物反应器构建容易，运行安全，表达外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白纯化方便，只需要通过饲养转基因家蚕，就可以非常方便地维持表达系统的延续，是一种非常有价值的表达系统，具有广阔的实用前景。本专利技术是利用转基因家蚕技术将狂犬病病毒糖蛋白基因导入家蚕基因组内，并在家蚕中部丝腺细胞、后部丝腺细胞、或两部分的丝腺细胞中特异表达，开发出合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的家蚕，为利用狂犬病病毒糖蛋白研制更加安全、高效、经济和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用转基因技术构建中部丝腺生物反应器、后部丝腺生物反应器、以及丝腺生物反应器三种生物反应器，使家蚕中部丝腺细胞、后部丝腺细胞或两部分丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。培育成功的生产狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种，可以提高蚕农养蚕经济效益，为利用狂犬病病毒糖蛋白研制更加安全、高效、经济和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基础。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下(1)采用分子生物学技术构建家蚕合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的载体 pBSerlRVGP-A3EGFP 质粒和 pBFibLRVGP_A3EGFP 质粒。(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBkrlRVGP-A3EGFP质粒或 pBFibLRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入家蚕受精卵内，蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代为Gl代，在Gl代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为G2代，G2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经1-3代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕中部丝腺生物反应器和后部丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。(3)在中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将pBFibLRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，在后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将pBkrlRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，受精卵孵化后饲养至成虫，自交续代为GGl代，在GGl代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为GG2代，GG2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达 EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。(4)将中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种，与后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种杂交为Fl代，在Fl代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为F2 代，F2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。所述的pBSerlRVGP-A3EGFP质粒是以piggyBac转座质粒为基础，质粒带有Amp抗性基因以用于质本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于该方法的步骤如下：（１）采用分子生物学技术构建家蚕合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的载体ｐＢＳｅｒ１ＲＶＧＰ－Ａ３ＥＧＦＰ质粒和ｐＢＦｉｂＬＲＶＧＰ－Ａ３ＥＧＦＰ质粒；（２）采用显微注射转基因家蚕方法将ｐＢＳｅｒ１ＲＶＧＰ－Ａ３ＥＧＦＰ质粒或ｐＢＦｉｂＬＲＶＧＰ－Ａ３ＥＧＦＰ质粒与能够提供转座酶ｔｒａｎｓ的辅助质粒一起导入家蚕受精卵内，蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代为Ｇ１代，在Ｇ１代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达ＥＧＦＰ标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为Ｇ２代，Ｇ２代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经１－３代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达ＥＧＦＰ标志基因为留种筛选标志，创制家蚕中部丝腺生物反应器和后部丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种；（３）在中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将ｐＢＦｉｂＬＲＶＧＰ－Ａ３ＥＧＦＰ质粒与能够提供转座酶ｔｒａｎｓ的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，在后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将ｐＢＳｅｒ１ＲＶＧＰ－Ａ３ＥＧＦＰ质粒与能够提供转座酶ｔｒａｎｓ的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，受精卵孵化后饲养至成虫，自交续代为ＧＧ１代，在ＧＧ１代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达ＥＧＦＰ标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为ＧＧ２代，ＧＧ２代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经２代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达ＥＧＦＰ标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种；（４）将中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种，与后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种杂交为Ｆ１代，在Ｆ１代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达ＥＧＦＰ标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为Ｆ２代，Ｆ２代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经２代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达ＥＧＦＰ标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，周继勇，庄兰芳，阮系真，危浩，颜焰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86