利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因(Myostatin)的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞。利用ZFNs介导的基因敲除，可以实现一次转染，得到双等位基因敲除的细胞克隆，这在常规基因打靶过程中是难以实现的，省去了药物筛选过程，有利于细胞单克隆的形成，避免了细胞需要对抗药物毒害的过程，对于后续的体细胞核移植和胚胎的发育质量起到了关键作用，同时不含有抗性基因，大大简化了生物安全评价过程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体地说，涉及一种。
技术介绍
基因打靶技术是一种定向改变生物体遗传信息的技术，常规基因打靶动物生产的两大限制因素为第一，动物体细胞基因打靶效率很低，10_6 10_7;第二，生产双等位基因敲除的动物时间周期长，克隆效率低。伴随着分子生物学的不断发展，涌现出很多新的技术和方法来提高基因打靶效率，如采用无启动子筛选的基因打靶策略，动物中干细胞的分离及诱导等。但是这些改进对于生产基因打靶动物并没有显著的推动作用，所以基因打靶动物的生产一直处于缓慢发展阶段。最近几年，锌指蛋白核酸酶(ZFNs)的出现极大地提高了基因打靶的效率，其将成为生产基因敲除动物的一个重要的突破口。肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)是转化生长因子β (Transforming Growth Factor-β，TGF-β )超家族成员，是一种作为肌肉生长负调控因子的分泌型蛋白。在胚胎发育过程中，myostatin在生肌节细胞和发育的骨骼肌中表达，调控形成肌纤维的最后数量。 在成年动物体内，myostatin主要在骨骼肌中特异表达，并控制肌纤维的生长。myostatin 的基因敲除和自然纯合突变在小鼠、牛、狗和人类均表现出骨骼肌的显著增加。myostatin以一种前体蛋白的形式被合成，经历一系列蛋白水解过程产生具有生物活性的分子，或者称其为成熟区域。第一次水解去除了由M个氨基酸组成的信号肽，这个信号肽对于蛋白进入分泌旁路是必需的。接着，在位于第240-243位氨基酸的RSRR(精氨酸-丝氨酸-精氨酸-精氨酸)位点发生第二次水解，产生一个分子量27，680道尔顿的 N-端片段(被称作前肽)以及12，400道尔顿大小的C-端片段。根据对其它TGF-β成员的了解，前肽对于C-端区域正确折叠成为半胱氨酸结结构具有重要的作用。而C-端片断是具有生物活性的部分。它通过二硫键连接形成C-端片段二聚体，并且折叠为半胱氨酸结结构，继而发挥作用。肌肉生长抑制素基因人工敲除的小鼠(McPherron AC等，1997，nature. 387 83-90)，表现出骨骼肌显著、广泛的增加，包括胸部、前肢、后肢以及整个身体被层，单个肌肉重量约为野生型小鼠的二倍。所有被检的骨骼肌都受到了基因突变的影响而发生了增加，并且雄性和雌性增加与其体型和体重按一定比例。对纯合突变小鼠肌肉制备的切片观察分析则表明这些小鼠既有肌纤维数量的增多，又有肌纤维的肥大，肌肉量的增加是肌纤维数量以及肌纤维大小增加的双重结果。myostatin的生物学功能提示我们，对myostatin的敲除可以成为农业生产中一种增加肌肉的有效策略。通过基因打靶技术，将该基因失活，是研究其功能和和验证其生产应用价值一个理想的手段。锌指蛋白核酸酶(ZFNs)融合了 DNA调控元件特异性的结合DNA的特性以及内切核酸酶的催化活性，N末端的锌指蛋白能够特异的结合DNA序列，通过C末端内切核酸酶FokI的催化作用，使得DNA双链分子产生断裂(DSB)，紧接着DSB就会启动细胞内自身修复机制。目前主要的修复机制有两种一种是非同源重组的末端连接修复机制，另一种是同源重组修复机制。前一种修复机制是一种易错修复常常会产生遗传信息的改变，而利用同源重组修复机制来修复DSB是一种高保真的修复方式，一般以另一条姐妹染色体为模板进行精确修复。在哺乳动物细胞内，前一种修复机制占主导作用，借助ZFNs特异性产生DSB， 引发细胞非同源重组的末端连接修复，在DSB位点引入小片段删除，或者插入，造成移码突变，或者蛋白关键序列的缺失达到基因敲除目的(图1)。应用ZFNs介导基因敲除或者修饰在斑马鱼，拟南芥等模式生物中已经成功实现， 并且效率较高 10 50% (Doyon,Y.等，Nat. Biotech. 2008,26 :702-708 ；Lloyd, Α.等，PNAS 2005，102 :2232-2237)。本专利技术证实了利用ZFNs在动物体细胞内进行基因的删除或者精细修饰是一种行之有效的方法，能够成功获得基因敲除克隆牛。常规基因打靶克隆牛的生产流程，包括构建基因打靶载体，载体转染，细胞药物筛选，细胞单克隆的鉴定，体细胞核移植，克隆牛的鉴定。如果需要对第二个等位基因也进行敲除，需要经历上述同样的过程，即需要进行两次细胞克隆，并且最后得到的克隆牛含有药物筛选时所必须的抗性基因，最后要得到不含有抗性基因的动物个体还要经历一次体细胞克隆。以牛为例完成上述过程需要的时间为载体构建3个月，细胞筛选1个月，体细胞核移植、胚胎发育1个月，胚胎移植妊娠到小牛出生10个月。这样，一次克隆至少需要14个月的时间。并且在细胞筛选过程中，有些甚至无法得到阳性单细胞克隆。如果实现无抗性基因的基因敲除牛需要进行三次克隆，则所需时间就至少需要42个月，周期长、风险高。而研究证明，利用ZFNs技术，可以在12个月内得到双等位基因完全敲除并且不含有抗性基因的克隆牛。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，其中，设计特异的锌指结合蛋白酶ZFNs，其作用的 DNA序列为ZFNs-Setl :GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT。前述的方法，包括如下步骤1)构建MSTN-ZFNIet 1真核表达载体。ZFNs以二聚体(异型)形式发挥作用(图 1)，故每一个作用位点需要两个锌指蛋白核酸酶表达元件；二聚体(异型)在锌指蛋白结合位点的锌指蛋白不同，即结合的DNA序列不同，在R)kl酶切结构域有共同的DNA切割域。以 MSTN-ZFN-Set 1为例，MSTN-ZFN-Set Ι-pZFNl和pZFN2两个锌指蛋白核酸酶需要同时表达才能一起发挥敲除MSTN基因的功能，因此在构建载体时可分别构建MSTN-ZFN-kt 1-pZFNl 和MSTN-ZFN-ktl-pZFN2的真核表达载体，将两个载体同时转染到细胞中实现两个锌指酶同时表达。以下为表达载体的构建原理MSTN-ZFN4etl-pZFm和MSTN-ZFN4etl-pZFN2表达载体，碱基序列(编码区)分别如SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2所示。锌指蛋白核酸酶编码部分，由两部分组成结合特异染色体序列的锌指蛋白结合域；非限制性内切核酸酶i^ok I切割域。锌指蛋白结合域的设计和构建可参考美国No. 6，453，242和6，534，沈1。本专利技术 ZFNs设计含有5个锌指蛋白单体，可特异结合15个碱基对。锌指蛋白的作用机理可参考 miller 等(1985) EMBO J. 4 1609 ；Rhodes (1993) Scientif ic American Feb. :56_65。非限制性内切核酸酶I7OkI切割域，由IIS型I内切核酸酶构成，其作用方式和机理可参考 Li 等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 89 :4375-4279 ；Li 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 90 :2764-2768 ；Kim 等(本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ＺＦＮｓ特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，其特征在于，设计特异的锌指结合蛋白酶ＺＦＮｓ，其作用的ＤＮＡ序列为：ＺＦＮｓ－Ｓｅｔ１：ＧＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＧＧＡＧＴＧＴＧＡＧＴＡＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴ。

【技术特征摘要】
1.一种利用锌指核酸酶敲除牛肌肉抑制素基因的方法，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入牛的成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，其特征在于，设计特异的锌指结合蛋白酶ZFNs，其作用的DNA序列为ZFNs-Setl :GTCATTACCATGCCCACGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGGT。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤1)构建MSTN-ZFNIet1-pZFm和MSTN-ZFNIetl_pZFN2表达载体，它们的碱基序列分别如 SEQ ID NO 1...

【专利技术属性】
技术研发人员：于胜利，罗俊杰，丁方荣，李松，汤波，李宁，
申请(专利权)人：北京济福霖生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11