本发明专利技术公开了一种使用人工染色体构建转基因斑马鱼的技术及其辅助质粒。本专利使用这一技术构建了蓝色荧光转换黄色荧光的心血管系统转基因系。步骤包括：1）特异性人工染色体获得及目的基因的构建2）人工染色体重组插入目的基因3）重组的人工染色体导入斑马鱼受精卵4）阳性转基因系筛选。本技术发明专利技术是一种具有国际领先水平的细菌人工染色体重组工程技术，极大的提高了转基因构建效率，将为我国生物医学基础研究和药物研究提供有力的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种细菌人工染色体的重组工程技术，及应用其构建心血管系统带有蓝色荧光并可转换为黄色荧光的转基因斑马鱼模型的方法。
技术介绍
心脏是人体的第一个发育的器官，是所有生命活动的能量供给动力中心。它通过大血管，微血管和血液构建的循环系统脉冲式的压迫血流将氧气和营养供给组织和器官， 同时带走代谢产物。心血管疾病是死亡率最高的疾病，每年大约有30%的死亡与之有关。 内皮细胞是心血管的最内层的细胞，具有多种合成和代谢功能，包括调节血栓及其溶解，血小板黏附，调控血管节律和血流，通过控制白细胞，单核细胞和淋巴细胞调节免疫和炎症反应。内皮细胞的损伤，会导致动脉粥样硬化和心肌梗死等多种致命心血管疾病。血管内皮生长因子(VEGF)受体/从广泛分布在整个心血管内皮系统，对于模式动物斑马鱼心血管系统flk基因进行荧光标记，可以方便的观察研究心血管病理进程。Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。基于fre-h^系统的荧光转换功能可以对相关基因在心血管的表达进行监控，揭示基因与疾病的关系。细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC)是一种基于细菌质粒的系统，被广泛应用于基因组测序及图谱绘制，疾病基因的定点克隆，近来开始被用于转基因动物的建立。相对于其他克隆系统而言，BAC系统有着很强的可操作性及应用优势。 BAC携带了完整的基因表达启动子及相应调控元件，对构建高精度转基因斑马鱼系及其他转基因动物有着极其重要的意义。BAC系统可以被看作一个较大的质粒，与所有分子遗传学的常规技术兼容。通过重组工程菌SW105进行BAC重组，方便准确的修饰BAC。这种工程菌提供了Beta和Gmfi种功能，fe 保护导入的线性DNA免遭监cBO)酶切，￡ro提供了 5’到3’核酸外切活性，ifete与被外切后的单链DNA结合，提供保护。本专利技术融合了人工染色体重组，fre-hf系统等多种技术，通过技术优化，提高了效率，构建了高精度的心血管系统荧光转换斑马鱼，为后基因组时代心血管疾病与基因功能研究及应用提供了有效工具。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供一种构建心血管系统带有蓝色荧光并可转换为黄色荧光的转基因斑马鱼模型的方法。技术方案，其特征在如下步骤实现3k、flk BAC 导入工程菌 SW105，其中 flk BAC 为 CH211-231B5 ；B、采用目的片段5，引物5，-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCA GACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ 禾Π目的片段 3，引物5，-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCA GAGTAGTGAGGAG-3，扩增pPCRBIoxYkanFrt中的荧光转换基因元件；C、荧光转换基因元件的电击导入含flk-BAC感受态细胞，并大量培养；D、清除插入基因片段所带筛选抗性；E、引入Tol/IScel转座位点提高整合效率其中插入位点1引物上游引物5 '-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’下游引物5 '-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’Tol/IScel插入位点2引物上游引物5 '-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’下游引物5 ‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3，；F、斑马鱼胚胎的注射；G、潜在的成功转基因鱼筛选。有益效果1)对于心血管系统广泛表达的血管内皮生长因子(VEGF)受体/从进行荧光标记。2)采用完整的flk基因表达启动子及相应调控元件以调节荧光报告子表达，而非简单的部分短片段的质粒构建。3)主要技术细节包括d BAC的前期处理，引物设计，感受态工程菌的准备，温度诱导重组，d BAC的重组后鉴定及大量提取技术。4)无需分离启动子，相对于受限于启动子构建标记的转基因系的技术，很大程度上提高了转基因系构建的广泛性，为基础医学和应用科学研究提供了自由。5)本专利技术在应用BAC重组工程的同时，融合了近期出现的转座技术，使用 Tb^ 和Zs^/转座子，提高了人工染色体整合到斑马鱼基因组的效率，提高了构建的成功率。6)将重组后的d BAC导入斑马鱼胚胎。包括显微注射方法，剂量步骤，优化的 Fo交配筛选方案。附图说明图1血管系统标记基因/从BAC克隆CH211-231B5结构示意图； 图2插入到BAC中的蓝色变黄色荧光基因序列质粒；图3插入到BAC中的转座基因序列质粒，包括tol2 RIsceI位点； 图4 cre-lox原理示意图未加ere的基因只表达蓝色荧光，不表达终止信号后片段。 加入ere后可于Iox位点处切割重组，基因因此表达黄色荧光； 图5细菌人工染色体重组原理示意图；图6重组后BAC酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳；图7构建好的转基因斑马鱼心血管系统呈蓝色荧光，在fre mRNA的作用下转化为黄色荧光；图8插入到BAC中的蓝色变黄色荧光基因序列质粒，其电泳检测确定PCR结果的电泳图。具体实施例方式实施例1 培育心血管系统带荧光并可进行荧光颜色转换的斑马鱼转基因系。含flk BAC工程菌的准备 Dflk BAC的来源/7左基因广泛分布于心血管系统，其BAC克隆为CH211-231B5 (图1)，该信息可直接到 zfin.org 查询。本专利技术中使用的 flk BAC 购自 CH0RI-211 文库(Children’ s Hospital Oakland Research Institute in Oakland, California, USA. http://bacpac. chori. org), BAC 的大小为 156. 559kb，序列详见 GenBank : BX24796. 6。2、flk BAC 导入工程菌 SW105a.将含/7左 BAC 克隆的菌株(Children，s Hospital Oakland Research Institute in Oakland, California, USA)在含12. 5 μ g/ml氯霉素抗性的LB培养基平板划线，37°C 培养过夜。b.挑取4个克隆，在含12.5 μ g/ml氯霉素抗性的5ml LB液态培养基37°C培养过夜。c.进行BAC的小量提取，参见下述步骤5。d.使用SpeI 37°C酶切过夜，在0. 7%的琼脂糖凝胶上电泳检测BAC大小是否正确。e. M SW105 ^^ (SW105, ^ g National Cancer Institute at Frederick, USA)在5ml无抗生素的LB培养液中，30°C振摇过夜。次日，1 100稀释本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法，其特征在如下步骤实现：Ａ、ｆｌｋ ＢＡＣ导入工程菌ＳＷ１０５，其中ｆｌｋ ＢＡＣ为ＣＨ２１１－２３１Ｂ５；Ｂ、采用目的片段５’引物 ：５’－ＣＡＴＡＣＧＡＧＴＡＴＣＡＴＴＣＧＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＡＧ ＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＧＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＴ－３’ 和目的片段３’引物 ：５’－ＡＴＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡ ＴＡＣＡＡＣＧＧＣＴＡＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧ－３’ 扩增ｐＰＣＲＢｌｏｘＹｋａｎＦｒｔ中的荧光转换基因元件；Ｃ、荧光转换基因元件的电击导入含ｆｌｋ－ＢＡＣ感受态细胞，并大量培养；Ｄ、清除插入基因片段所带筛选抗性；Ｅ、引入Ｔｏｌ／ＩＳｃｅＩ转座位点提高整合效率：其中Ｔｏｌ／ＩＳｃｅＩ插入位点１引物：上游引物：５‘－ＡＣＣＣＡＡＴＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＡＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧ ＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＣ－３’下游引物：５‘－ＧＡＴＣＴＧＣＡＧＣＡＴＡＴＣＡＴＧＣＧＴＧＴＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＴＣ ＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＣＧＡＣＣＣ－３’Ｔｏｌ／ＩＳｃｅＩ插入位点２引物：上游引物：５‘－ＧＧＧＣＡＴＣＧＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＧＧＡＣＴＡＴＡＴＴＧＣＴＣＧ ＡＧＣＧＧＣＣＧ ＣＣＡＧＴＧＴＧＡＴＧＧ－３’下游引物：５‘－ＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＧＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＧＴＧＣＡＧＧ ＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＣＣ－３’；Ｆ、斑马鱼胚胎的注射；Ｇ、潜在的成功转基因鱼筛选。...
【技术特征摘要】
1. 一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法，其特征在如下步骤实现k、flk BAC 导入工程菌 SW105，其中 flk BAC 为 CH211-231B5 ；B、采用目的片段5，引物5，-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCA GACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ 禾Π目的片段 3，引物5，-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCA GAGTAGTGAGGAG-3，扩增pPCRBIoxYkanFrt中的荧光转换基因元件；C、荧光转换基因元件的电击导入含flk-BAC感受态细胞，并大量培养；D、清除插入基因片段所带筛选抗性；E、引入Tol...
【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，顾爱华，吉贵祥，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：84
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