一株通过基因修饰以优化表达后的狂犬病病毒糖蛋白及其单克隆抗体和应用制造技术

本发明专利技术公开了经修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该G蛋白基因G3表达得到的经修饰的狂犬病病毒的G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述狂犬病病毒为狂犬病病毒（rabies virus，RV）HEP-Flury株。利用上述修饰的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白基因G3构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体能特异性识别狂犬病病毒糖蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学和生物
更具体地，涉及一株通过基因修饰以优化表 达后的狂犬病病毒糖蛋白及其单克隆抗体和应用。
技术介绍
狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RV)引起的人兽共患的烈性传染病，一旦 发病难以医治。准确、及时、快速的诊断是临床治疗的前提，也是免疫监测、流行病学调查的 主要手段，还是有效控制狂犬病的关键。狂犬病病毒的糖蛋白（glycoprotein，GP)，即G蛋 白，是狂犬病病毒主要的结构蛋白之一，与病毒的感染和免疫有密切关系，是诱导产生中和 抗体的主要蛋白，其免疫作用与全病毒疫苗基本相当。GP由524个氨基酸组成，前19个氨 基酸构成疏水性信号肽，其膜外区的保守性高，且抗原表位主要集中在膜外区，是制备检测 抗体的首选抗原。 G蛋白的表达纯化是抗体制备的前提，合理的基因修饰可以实现蛋白的高效表达。 但是对于不同的基因、不同物种来源的同源基因（基因的序列和性质等具有差别），如何修 饰基因，确定修饰位点及修饰数量，致使其与表达菌的偏嗜性匹配，以提高蛋白的表达量； 表达过程中怎样进行培养、怎样保证获得蛋白表达需要的溶解氧、怎么样避免污染、加甲醇 诱导的量以及时间、对蛋白表达时间的控制即蛋白收获时间、无菌检验的方法、蛋白含量以 及活性的测定等均有较大的差异，需要形成一个稳定的、完整的技术方案，才能从根本上解 决G蛋白的高效表达和成本问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有狂犬病病毒G蛋白表达技术的不足，提供一 种经修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3,利用该修饰的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白基 因 G3构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，该单克隆抗体能特异性识别狂 犬病病毒糖蛋白和狂犬病病毒，可以应用于间接ELISA方法、Western-blotting试验和间 接免疫荧光试验，用于检测狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特异性。 本专利技术上述目的通过以下技术方案实现： -种通过基因片段进行密码子修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3,其核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1所示（修饰前的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 所示）。 -种经修饰的狂犬病病毒的G蛋白，由上述修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3表 达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 -种表达载体，该载体含有上述经修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3片段。 由上述表达载体表达达到的狂犬病病毒G蛋白在制备抗狂犬病病毒G蛋白的单克 隆抗体中的应用也应在本专利技术的保护范围之内。 一种抗狂犬病病毒G蛋白的抗体，采用的免疫原是以上述表达载体表达达到的狂 犬病病毒G蛋白，即修饰后的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白中一段经分析挑选得到的抗 原表位富集区。 具体地，所述狂犬病病毒为狂犬病病毒HEP-Flury株。另外优选地，所述抗体为单 克隆抗体。 一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接ELISA方法，所用抗体是以经 修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。 一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的Western-blotting检测方法，所 用抗体是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。 一种不以疾病诊断为目的的检测狂犬病病毒的间接免疫荧光检测方法，所用抗体 是以经修饰的狂犬病病毒的基质蛋白为抗原制备得到的抗体。 本专利技术首先对狂犬病病毒H印-flury株G蛋白基因进行了合理的修饰改造，然后 构建了含有经修饰优化的狂犬病病毒H印-fIury株G蛋白基因的原核表达质粒pET32-G3， 在大肠杆菌中表达G3重组蛋白，并以此为基础制备G3单克隆抗体，为G3单克隆抗体在间 接ELISA方法、Western-blotting试验和间接免疫荧光试验检测狂犬病病毒的应用创造条 件。 本专利技术利用大肠杆菌表达系统，表达出了 G3重组蛋白，表达产物的相对分子 质量为39kDa，与理论计算值一致；重组蛋白的最佳诱导表达条件：在28°C的条件下，以 1.0 mmol/L的IPTG终浓度，诱导4h。 本专利技术G3基因的获得是运用生物学信息软件对狂犬病病毒HEP-Flury株糖蛋白 膜外区序列进行分析，选择抗原表位优势区段100~307为氨基酸，依照大肠杆菌密码子 偏嗜性，对其氨基酸密码子进行修饰，于5'端和3'端分别引入BamHI及Hind III酶切位 点，继而PCR扩增，构建克隆载体pMD18T-Simple-G3,再与pET-32a(+)表达载体的BamHI、 Hind III双酶切反应，回收产物并且连接成功构建PET32-G3重组表达载体，重组质粒DNA序 列测定结果证实了含有目的基因。将重组表达载体转化DH5a感受态细胞，筛选得到的阳 性重组子鉴定正确后提取质粒转化BL21感受态细胞进行IPTG诱导表达，诱导表达后，离心 收集菌体进行SDS-PAGE分析。当基因进行表达后，表达产物为融合有His标签的G融合蛋 白，融合蛋白的相对分子质量39kDa。 本专利技术用纯化的His标签-G3融合蛋白作为抗原，既增加了抗原的免疫原性，又方 便筛选。专利技术中采用纯化His标签-G3融合蛋白作为包被抗原进行筛选，同时设立阴阳性对 照，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以正常小鼠的血清为阴性对照，间接ELISA反应条件的 确立是经过多次试验优化的结果。此外，在单抗的筛选过程中，始终选用空载体pET32a(+) 菌体蛋白与pET32a-M蛋白作为对照抗原，避免了用同种免疫原检测时假阳性的出现，充 分保证能够得到目的杂交瘤细胞；而且在筛选方法上，也应用了不同的选择系统，以间接 ELISA为主，用Western-blotting与IFA确认，从而确保了单克隆抗体的反应特异性。由于 筛选出的上清液为阳性的生长孔内常会有两个以上的杂交瘤细胞集落，有的集落可能不分 泌抗体，或分泌的不是所需抗体，所以，要利用克隆培养方法及时将其分开。本专利技术中，采用 了有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆培养。 本专利技术以纯化的His标签-G3融合蛋白为抗原，免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤 技术制备抗狂犬病病毒糖蛋白的单克隆抗体，获得3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株： 2-D2、4-Hl与9-G4,并成功制得腹水，测定腹水效价均在1:105以上。抗体亚型鉴定结果显 示，单抗亚型为IgGL且轻链为κ链。杂交瘤细胞株连续培养30代以及冻存3个月后复 苏，细胞生长良好，杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。经ELISA、Western-blotting与IFA 检测，3株单抗具有很好的特异性。 本专利技术具有以下有益效果： 本专利技术以RV HEP-Flury株的全长质粒为模板，采用PCR方法扩增获得GP去除信 号肽基因的部分（Gl)与膜外区基因（G2)。选取膜外区基因中抗原表位富集区基因，对其氨 基酸密码子进行修饰并合成其序列（G3)。分别将G1、G2及G3基因片段亚克隆到表达载体 pET32a(+)，构建融合表达质粒pET32-Gl、pET32-G2及pET32-G3,转化表达宿主菌BL21，并 利用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western_blotting和薄层扫描分析结果显示，表达的蛋白 均具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过基因片段进行密码子修饰的狂犬病病毒的G蛋白基因G3，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭霄峰，张戴婷，郑佳琳，阳佑天，王怡飞，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44