本发明专利技术涉及生物技术领域，提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白、编码该融合蛋白的DNA序列、含有该DNA序列的载体、含该载体的宿主细胞或者转基因动物、该融合蛋白的制备方法以及该融合蛋白的应用。本发明专利技术所述TRAIL融合蛋白从N端至C端包括人源亮氨酸拉链序列以及人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段，可以显著增加稳定性以及延长在动物体内半衰期，显著的提高治疗效果，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，具体涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和其在医药领域的应用。
技术介绍
肿瘤是一类严重威胁人类健康与生命的疾病，肿瘤的治疗已经成为日益迫切需要解决的重大公共卫生问题。近年来尽管抗肿瘤药物研究已经有了很大的发展，但仍存在着针对性差，对正常细胞也产生杀伤作用等缺陷，使之应用受到很大限制。因此，研制靶向性杀伤肿瘤细胞的基因工程药物仍具有重大的社会效益与经济效益。1995年,Wiley SR等报道从人表达标签序列文库(EST, expressed sequence tag)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白的基因，该基因编码的蛋白称为肿瘤坏死因子相关凋亡配体·(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL),又称凋亡素 2配体(Apo2L),属于肿瘤坏死因子超家族(Wiley SR, et al. , Immunity 3:673-682,1995)。TRAIL与DR4或DR5受体结合后，DR4和DR5的死亡结构域传导凋亡的信号通过FADD和依赖caspase 8机制在细胞内途径和细胞外途径实现的。TRAIL对于大多数恶性肿瘤有抑制细胞生长和细胞毒效应，而人体的正常细胞则对TRAIL诱导的凋亡耐受(Ashkenazi A, etal. ,J Clin Invest 104 :155_162，1999)。因其特异性地诱导肿瘤细胞发生凋亡，而对正常细胞没有显著细胞毒性的特点，因此TRAIL在肿瘤治疗中具有良好的前景，自发现以来一直被作为肿瘤治疗研究的热点。TRAIL虽然在体内体外实验以及临床实验中均显示了很显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，但是半衰期比较短，人体内半衰期仅有40分钟，严重影响了 TRAIL蛋白在体内的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种TRAIL融合蛋白，此种融合蛋白可以显著的增加蛋白稳定性以及延长在动物体内半衰期，显著的提高治疗效果。本专利技术提供的TRAIL融合蛋白包括⑴人源亮氨酸拉链结构域；⑵人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)是一种在本
内被熟知的蛋白。TRAIL核苷酸序列GenBank登录号NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作为死亡受体DR4 (TRAIL-RI)和死亡受体DR5 (TRAIL-RII)的配体，与其结合诱导凋亡或细胞死亡。人源TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示，其胞外区是从N端开始的第41位至第281位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示.依照本专利技术，一种TRAIL融合蛋白从N端至C端具有如下序列(1)人源亮氨酸拉链序列；(2)根据情况可有一不多于10个氨基酸的连接区；(3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段，可以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)或者死亡受体 DR5 (TRAIL-RII)相结合。基于本专利技术的目的，融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全长或者部分片段，长度足以与死亡受体DR4 (TRAIL-RI)和死亡受体DR5 (TRAIL-RII)结合。优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外区，包含天然人源TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段。更加优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一种TRAIL蛋白的可溶性片段，包含TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜区以及胞内区。在一种实施方案中，本专利技术所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID NO:·2所示氨基酸序列。作为优选,其中所述人源亮氨酸拉链结构域为人c-fos, c-jun, c-myc, max、mdxl或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。在本专利技术的具体实施例中，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如SEQ ID N01所示的氨基酸序列。在一种实施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。本专利技术也提供了包含3个融合蛋白分子的寡聚体，这种寡聚体的形成是通过亮氨酸拉链结构域进行加强的。本专利技术也涵盖了编码融合蛋白的DNA分子。在一种实施方案中，所述DNA分子含有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。另一方面，本专利技术提供了包括转录起始区，受转录起始区调控的编码本专利技术所述的融合蛋白的DNA分子以及转录中止区的表达盒以及重组了编码所述融合蛋白DNA分子的表达载体。作为优选，所述表达载体为质粒或病毒。此外，本专利技术进一步提供了重组了编码本专利技术所述的融合蛋白的DNA分子以及表达所述的融合蛋白的细胞和转基因动物。该细胞可以是哺乳动物细胞，昆虫细胞，酵母或者细菌。转基因动物可以是转基因羊，牛，等等。在本专利技术的实施例中，具体提供一种重组了编码本专利技术所述的融合蛋白的DNA分子的大肠杆菌，所述大肠杆菌于2011年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4953。另外，本专利技术也提供了所述融合蛋白的生产方法，包括以下步骤含有编码本专利技术所述的融合蛋白的DNA分子的细胞或转基因动物，该细胞或转基因动物表达所述融合蛋白以及分离所述融合蛋白。在又一个方面，本专利技术提供了所述的融合蛋白的应用，即生产用于治疗一种疾病的药物，例如，由不可控制的细胞生长导致的人类疾病如，肿瘤，银屑病，自身免疫性疾病坐寸ο动物试验显示，人源TRAIL蛋白对照组对肿瘤的抑制率为35. 8%，而本专利技术所述融合蛋白组肿瘤完全消失，且裸鼠状态明显好于给予人源TRAIL蛋白的阳性对照组，表明与TRAIL相比，本专利技术所述融合蛋白毒性更低。另外，本专利技术所述融合蛋白的体内消除速度明显低于TRAIL蛋白，说明融合蛋白与TRAIL相比半衰期明显延长。生物保藏说明菌株LZ-TRAIL95CS，分类命名大肠埃希氏菌，Escherichia coli.于2011年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 4953。附图说明图I显示的是融合蛋白结构示意图。A-人源亮氨酸拉链结构域B-连接区C-TRAIL 胞外区图2显示的是LZ-TRAIL蛋白的表达与纯化的SDS-PAGE鉴定结果。泳道I :未诱导的细胞裂解物；泳道2 :0. 2mM IPTG诱导后的细胞裂解物；泳道3 :蛋白分子量标准；泳道4 :金属亲和层析纯化后的LZ-TRAIL蛋白；泳道5 :离子交换层析纯化后的LZ-TRAIL蛋白。箭头所示为目标蛋白。图3显示的是纯化后的LZ-TRAIL蛋白(未突变)的还原与非还原SDS-PAGE鉴定结果。泳道I :非还原SDS-PAGE鉴定结果；泳道2 :蛋白分子量标准；泳道3 :还原SDS-PAGE鉴定结果。箭头所示为目标蛋白。图4显示的是纯化后的LZ-TRAIL蛋白(突变后)的还原与非还原SDS-PAGE鉴定结果。泳道I :还原SDS-PAGE鉴定结果；泳道2 :蛋白分子量标准；泳道3 :非还原SDS-PAGE鉴定结果。箭头所示为目标本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，包括：(1)人源亮氨酸拉链结构域；(2)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周兵，周宇，姜静，
申请(专利权)人：山东先声麦得津生物制药有限公司，江苏先声药物研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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