本发明专利技术公开了高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。该高通量筛选高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法包括如下步骤：比较经流式细胞仪鉴定的表达外源蛋白的重组里氏木霉的红色荧光强度，根据红色荧光强度的高低鉴定外源蛋白的表达能力，红色荧光强度越高的表达外源蛋白的重组里氏木霉的外源蛋白表达能力越高。其中的外源蛋白基因以融合基因的形式导入里氏木霉，该融合基因是将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到的融合基因，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5′端具有信号肽序列；所述连接肽2A序列编码序列表中序列8的第290-306位所示的连接肽2A。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是纤维素酶、半纤维素酶的主要工业生产菌株，该菌是美国FDA认证的食品安全级的工业生产菌株，具有强大的蛋白分泌能力，某些突变株的外分泌蛋白量可达100g/L，并且具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉是一种非常理想的重组蛋白表达宿主，得到国际著名酶制剂公司(如Genencor、Novozymes等)高度重视,并成功应用于多种药物、化学试剂以及酶试剂的表达和生产。同时，里氏木霉的发酵工艺成熟，发酵成本较低，为其投入工业化生产奠定了良好的基础。近年来，随着里氏木霉基因组学的快速发展以及其遗传操作系统的不断完善，利用里氏木霉表达异源蛋白也越来越受到重视。值得指出的是外源DNA片段多以非同源末端连接的途径NHEJ (nonhomologousend-joining)整合入宿主基因组，呈随机插入的形式。异源蛋白的表达框在基因组中的不同位置会直接影响到其表达水平。例如，若外源基因插入了沉默子的调控区可能直接导致其不能转录而表达失败，如果外源基因插入增强子的可调控区域也可能使其表达量有大幅度的提高。另一个方面，外源基因进入基因组后，其在基因组中的拷贝数也是随机的，而拷贝数本身也是影响表达量的一个重要因素。由于里氏木霉基因组信息的不完善以及其同源重组率的局限性，很难确定基因组中具体哪一个位置更有利于基因的表达，同时，对所有转化子进行拷贝数鉴定本身也是十分繁琐的工作。随着里氏木霉遗传操作体系的不断优化，其转化效率已经可以基本满足人们的需要，但当得到大量的转化子，如何筛选目的蛋白高效表达的转化子成了问题的关键。对于重组蛋白的异源表达，传统的筛选手段只能是挑取大量的转化子进行发酵后，对目的蛋白进行活性测定等方法进行筛选，这样的方法比较繁琐，需耗费大量的人力物力，而且从得到转化子到筛选到高效表达的菌株周期也比较长。更重要的是，随着转化效率的不断提高，用传统的方法很难对所有的转化子进行鉴定，这样很容易把一些真正的高表达菌株遗漏掉。这就需要建立一种高通量的筛选方法。流式细胞仪技术(flow cytometry)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物颗粒等进行快速定量分析和分选的技术。流式细胞仪将流体喷射技术、激光技术、空气技术、Y射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器，通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。2003年BD公司推出了世界上首款台式高速多荧光检测和分选的流式细胞仪FACS Aria，其主要用途是从细胞群中高速分选出被指定的细胞，其分选准确度高，速度快，可达到70000个/S。由于分选时间短，使分选到的细胞活性良好，并且它可以将细胞分选至流式细胞管、培养皿、细胞培养板(6孔板、24孔板及96孔板)，以便作进一步鉴定、功能研究或细胞培养。目前，流式细胞仪分选技术已广泛应用于医学研究，但其在丝状真菌领域的应用较少。目前，国内外尚没有利用流式细胞仪分选技术高通量筛选高效表达重组蛋白的里氏木霉工程菌的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是提供一种鉴定或辅助鉴定高效表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法。本专利技术所提供的鉴定或辅助鉴定表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤I)将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5'端具有信号肽序列；所述连接肽2A序列编码序列表中序列8的第290-306位所示的连接肽2A ；2)制备融合基因表达盒和筛选标记基因表达盒以及含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体；3)用含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体转化里氏木霉，得到转化子；培养所述转化子并将所有转化子制备成原生质体，收集所述转化子的原生质体细胞；4)用流式细胞仪对步骤3)的所述原生质体进行分选，有红色荧光的所述转化子为表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选表达外源蛋白的重组里氏木霉，无红色荧光的所述转化子为非表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选非表达外源蛋白的重组里氏木霉。其中，表达盒是包含目的基因(所述融合基因或所述筛选标记基因)及其表达所必需的所有调控序列的单链或双链核酸分子。所述调控序列在其相容条件下能指导编码序列在合适的宿主细胞中表达目的基因。所述调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入载体的特定限制性酶位点以便将调控序列与目的基因的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。调控序列可以是合适的启动子序列，即可被表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导目的基因表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中有转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可以得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。调控序列还可以是合适的转录终止序列，即能被宿主细胞识别从而终止转录的一段序列。终止序列可操作连接在编码多肽的核酸序列的3’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何终止子都可以用于本专利技术。调控序列还可以是合适的前导序列，即对宿主细胞的翻译十分重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作连接于目的基因的5’末端。在所选宿主细胞中可发挥功能的任何前导序列均可用于本专利技术。在这些例子中，应将目的基因的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于目的基因的适当位置，以使调控序列指导目的基因的表达。其中，2)中的含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体可以是一个重组表达载体也可以是两个重组表达载体，即所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒位于同一个重组表达载体中或所述融合基因表达盒位于一个重组表达载体中，所述筛选基因表达盒位于另一个重组表达载体中。上述所述筛选基因表达盒中的筛选标记基因是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者抗生素如氨节青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。在本专利技术的实施例中，所述筛选标记基因为pyr4，是营养选择性标记基因乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶的基因。上述I)中的融合基因也属于本专利技术的保护范围。所述融合基因具体可为由红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到的DNA片段，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述连接肽2A序列的核苷酸序列为序列表中的序列7的第868-918位核苷酸。该连接肽2A序列是根据里氏木霉密码子偏好性设计的。本申请的实验证明，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游的融合基因比所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的下游的融合基因的外源蛋白表达量高。在本专利技术的一本文档来自技高网...
【技术保护点】
鉴定或辅助鉴定表达外源蛋白的重组里氏木霉的方法，包括如下步骤：1）将红色荧光蛋白基因通过连接肽2A序列与外源蛋白基因连接得到融合基因，所述外源蛋白基因位于所述红色荧光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5′端具有信号肽序列；所述连接肽2A序列编码序列表中序列8的第290？306位所示的连接肽2A；2）制备融合基因表达盒和筛选标记基因表达盒以及含有所述融合基因表达盒和所述筛选标记基因表达盒的重组表达载体；3）用所述重组表达载体转化里氏木霉，得到转化子；培养所述转化子并制备成原生质体，收集所述转化子的原生质体细胞；4）用流式细胞仪对步骤3）的所述原生质体细胞进行分选，有红色荧光的所述转化子为表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选表达外源蛋白的重组里氏木霉，无红色荧光的所述转化子为非表达外源蛋白的重组里氏木霉或候选非表达外源蛋白的重组里氏木霉。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董志扬，秦丽娜，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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