林可霉素残留快速检测试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种林可霉素残留快速检测试纸条及其制备方法。试纸条底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，吸附层从测试样品端依次为吸附纤维层、吸附偶联林可霉素的金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上有用林可霉素载体蛋白溶液印制的检测印迹以及用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹。该试纸条检测的特异性强、敏感性高，操作简便快速；检测结果显示形象、直观、准确，检测时不需专用仪器设备和专业人员，成本低，投资少，容易推广实施。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种林可霉素残留的检测器具，特别是涉及一种林可霉素残留快速检测的试纸条及其制备方法。
技术介绍
林可霉素(lincomycin, LIN)又称洁霉素,是由林肯链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素，分子式C18H34N206S，分子量406. 53，具有较强的抑菌活性，主要作用于革兰氏阳性细菌，是RNA依赖的乙酰胆碱酯酶抑制剂。LIN不具备突出的毒性，但是它在食品及药物中的残留通过食物链进入人体后易累积，可导致细菌的耐药性，导致对疾病缺乏治疗效率。因此，各国都对林可霉素有限量要求。中国农业部规定了 LIN在牛、羊、猪、禽中的最高残留限量，其中肌肉 lOOyg/kg、脂肪 lOOyg/kg、肝脏 SOOyg/kg、肾脏 MOOyg/kg。 目前国内外对LIN残留限量常用的检测方法主要有微生物法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法、高效液相色谱质谱串联法(UPLC-MS/MS)、液相色谱/质谱联用技术(LC-MS)、薄层色谱法(TLC)等。上述方法不仅需要昂贵的仪器设备和复杂繁琐的操作过程，并且对检验人员的技能要求较高,不适合现场监控和大量样本的筛查。因此,急切需要一种快速简便的LIN检测技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题提供了一种特异性强、敏感性高、快速简便检测林可霉素的试纸条，还提供了该试纸条的制备方法。本专利技术的技术方案 一种林可霉素残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，夕卜层保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联林可霉素载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；所述金标抗体纤维层用吸附林可霉素的金标抗体玻璃纤维棉制成，金标抗体为胶体金标记的抗林可霉素单克隆抗体。所述支撑层用硬质塑胶片条或不吸水的硬纸条制成；所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述吸水材料层用吸水纸制成。所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述外层保护层为吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖的保护膜，在吸附纤维层与金标抗体纤维层的交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧0. 3 0. 7cm。所述检测印迹和对照印迹为平行排列的“ Il ”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“T T”字型排列印迹，或为“丄丄”字型排列印迹，或为“卜P，字型排列印迹，或为“_| ”字型排列印迹。所述试纸条的制备方法包括以下步骤 (I)偶联林可霉素载体蛋白溶液的制备称取12. 6mg林可霉素置于反应器中，加入500 1000 μ L的PBS缓冲液溶解，得到LIN溶液；称取6. 7mg NaIO4置于另一反应器中，用500 1000 μ L双蒸水溶解，得到NaI04溶液；将NaIO4溶液在搅拌下逐滴加入到LIN溶液中，室温搅拌反应2h ； 称取载体蛋白15mg，用5mL PBS缓冲液溶解，得到载体蛋白溶液，置于4°C冰箱2h，备用JfLIN与NaIO4的反应液在搅拌下逐滴加入到载体蛋白溶液中，4°C搅拌反应2h ;然后加Λ 50 μ L、2mg/mL的NaIO4溶液，室温搅拌反应2h ;最后将反应液装入透析袋，用pH7. 4的PBS溶液透析3d，每8h换透析液一次，收集反应液，即得到林可霉素的偶联物溶液； (2)抗林可霉素单克隆抗体的制备； (3)林可霉素金标抗体的制备； (4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗体的制备； 用所得的偶联物溶液在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体在纤·维素膜层上制备对照印迹；百菌清金标抗体用于制备金标抗体纤维层，然后依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。所述林可霉素金标抗体是由以下方法制备的量取50 IOOmL沸腾的O. 01 O. 05%的氯金酸溶液，向氯金酸溶液中加入2 4mL、0. 5 2%的柠檬酸三钠溶液，反应后获得粒径10 15nm的胶体金颗粒；用O. lmol/L的K2CO3调节胶体金溶胶的pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的标记比将抗LIN单克隆抗体加入到胶体金溶胶中，标记IOmin ;力口Λ 20% 的 PEG 10000 至 PEG 10000 的终浓度为 O. 05%，4°C、1500 3000rpm 离心 20min，除去未结合的胶体金颗粒，4°C、15000rpm离心Ih,弃上清液；将获得的初步纯化的金标抗体蛋白混合物用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得LIN胶体金标记抗体；将I :100 500稀释的胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，于4°C低温真空干燥，制备LIN金标抗体。本专利技术的积极有意效果 (I)特异性强，敏感性高。LIN快速检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性及亲和力影响较小，且具有较高的标记率。(2)操作简便快速。使用本专利技术试纸条时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品中10秒左右，2分钟内即可判定检测结果。(3)结果显示形象、直观、准确。本专利技术试纸条以显示红棕色“ I ”(或“十”、“丁”、“丄”、“ ”)印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“ I ”印迹表示在被检测样品中含有LIN，显示两条棕红色“ I I ”印迹表示在被检样品中不含LIN。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性等人为误判。(4)成本低，投资少。使用该试纸条不需另配仪器设备及其它试剂，可随时随地进行检测，检测费用低廉。采用通常的仪器分析费用为300元每头/份，采用进口 ELISA试剂盒的检测费用为50元每头/份，本专利技术试纸条的检测费用为8 10元每头/份，检测费用大幅下降，可节省大量仪器和设备费用。(5)应用范围广，便于推广。本专利技术试纸条操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖及个体养殖等方面。本专利技术在保障食品安全和保护消费者健康方面具有极其重要的意义，具有较好的经济效益和社会效益。(6)本专利技术应用高碘酸钠制备免疫原及检测印迹，和其他方法相比，高碘酸钠氧化法是糖类或含糖基化合物分子中的邻二醇结构被高碘酸钠氧化为醛基，然后与蛋白分子中的氨基形成Schiff氏碱，反应过程比较温和，可在常温和中性pH条件下进行，易于操作和控制。附图说明 图I为本专利技术试纸条的结构示意 图2为本专利技术试纸条的俯视结构示意图。具体实施例方式 以下实施例是为了进一步说明本专利技术的内容，并不表示对本专利技术的限制。文中如没有特别说明，其中的百分含量均为质量百分含量。实施例一参见图I、图2。图中I为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为吸附纤维层(测试端)，用玻璃纤维棉制成，金标抗体纤维层3用吸附林可霉素的金标抗体玻璃纤维棉制成，金标抗体为胶体金标记的抗林可霉素的单克隆抗体。纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜制成，吸水材料层5采用吸水滤纸制成，将吸附纤维层2、金标抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种林可霉素残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是：吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联林可霉素载体蛋白溶液印制的检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的对照印迹；所述金标抗体纤维层用吸附林可霉素的金标抗体玻璃纤维棉制成，金标抗体为胶体金标记的抗林可霉素单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡骁飞，张改平，邢广旭，职爱民，王方雨，张小辉，杨继飞，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：