本发明专利技术公开一种基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条及其制备方法，试纸条含有支撑层、吸附层、保护层，吸附层包括吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，纤维素膜层上设有用偶联CL的载体蛋白溶液印制的检测印迹以及用羊抗小鼠IgG抗体印制的对照印迹；荧光抗体采用NaYF4:Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体。本发明专利技术实现了基于上转换荧光纳米材料标记的免疫层析技术在定量检测CL残留中的应用，使CL残留检测无本底干扰；该试纸条特异性强、灵敏度高，检测简便、直观、准确，成本低，适用范围广，易于推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种以上转换荧光材料作为生物标记物的用于定量检测克伦特罗残留的免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
克伦特罗(Clenbuterol，CL)，俗称“瘦肉精”，盐酸克伦特罗是其盐酸盐，具有促进肌肉发育和脂肪分解作用，克伦特罗可以提高肉用动物的胴体瘦肉率。因为消费者对瘦肉的特殊偏好，瘦肉产出率高的猪可以卖个好价钱，添加“瘦肉精”给养殖户带来了额外收益。因此，受不法利益的驱使，养殖户常在养殖环节添加“瘦肉精”到动物饲料中去。但是克伦特罗是一种选择性β 2-肾上腺素受体激动剂，副作用极大，当摄入量较大时会造成心血管系统的损害和严重的神经症状。当人们食用了含克伦特罗残留的动物内脏和肉品后，会造成急性或慢性食肉中毒，危害消费者的健康。目前为止没有一个国家批准“克伦特罗”可用于动物生产中，但长期以来一直存在着非法使用的情况，在世界各地造成严重食物中毒的事件并不鲜见。近年来在我国多个城市也出现了“瘦肉精”中毒事件，极大地威胁着消费者的身心健康。用于克伦特罗残留检测的方法较多，主要有(I)理化分析法，如高压液相色谱仪、气相色谱、薄层层析、电泳法等；(2)免疫分析法，如放射免疫法、酶联免疫吸附法等；(3)生物测定法，如微生物学测定法、放射受体测定法等。但这些方法需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，操作过程复杂，检测时间较长，限制了其应用范围，难以在实际生产中推广应用。免疫试纸法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程简单，用作“瘦肉精”的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术。上转换荧光技术(UPT)，是一种具有高灵敏度、基于上转磷光体(UCP)的新型生物检测技术，UCP具有独特的物理结构和光学特性，是一种完全惰性的无机发光材料，经过表面修饰与活化后，可作为新型标记物在生物检测领域应用。经检索，用于检测食品中农药、兽药残留的UCP免疫层析试纸未见报道，虽然胶体金试纸在此方面应用较广，但其不能做到定量检测，作为更敏感、稳定、灵活、安全的UPT-LF的研究，是胶体金免疫检测技术的有力补充，亟待加强该方面的研究和探讨。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题针对现有技术存在的不足，提供一种特异、灵敏、快速、简便、能定量检测克伦特罗残留的免疫层析试纸条及其制备方法。本专利技术的技术方案 一种基于上转换荧光纳米颗粒标记的检测克伦特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联CL的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体采用NaYF4:Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体。所述NaYF4:Yb:Er纳米颗粒是以NaYF4为基质、Yb3+为敏化剂，由Yb和Er共掺杂形成的直径为50-200nm的纳米颗粒。所述NaYF4: Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体由以下方法制备，具体步骤为 (O荧光纳米颗粒的表面硅化 将NaYF4: Yb: Er荧光纳米颗粒分散在质量浓度为10%的乙醇溶液中，在搅拌下加入5ml浓氨水，反应IOmin,然后加入2ml正娃酸四乙酯,室温反应3h ；6000rpm离心5min,水洗后用乙醇分散； (2)荧光纳米颗粒的表面氨基化 将表面硅化的荧光纳米颗粒加入体积比为3:5的甲醇、丙酮的混合溶液中，经超声波分散，加入5 μ I的Ν-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，70°C水浴反应lh，6000rpm离心5min,将得到的沉淀用乙醇洗漆，干燥； (3)CL抗体的标记 将表面经氨基化修饰的NaYF4:Yb:Er纳米颗粒用PBS缓冲溶液分散，向其中加入质量浓度25%的戊二醛溶液，室温反应3小时，离心洗去多余的戊二醛，然后将反应液分散在PBS缓冲溶液中，加入CL的单克隆抗体或多克隆抗体，4°C反应3小时，经离心洗涤，即得到NaYF4:Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体，置于PBS缓冲溶液中，4°C保存。所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜； 偶联CL的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述隐形检测印迹和隐形对照印迹为平行排列的“ I I ”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“T T”字型排列印迹，或为“I I”字型排列印迹，或为“ h P’字型排列印迹，或为H ”字型排列印迹。在所述吸附纤维层、荧光抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在吸附纤维层与荧光抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向吸附纤维层一侧 O. 3-0. 7cm。所述的NaYF4:Yb:Er纳米颗粒采用共沉淀法制备，具体方法如下分别取浓度为 O. 2mol/L 的 Y(NO3) 3 20ml,O. 2mol/L 的 Yb (NO3) 3 2ml,O. 2mol/L 的Er (NO3) 3 O. 5ml、lmol/L的EDTA_Na21ml，加入烧瓶中，50°C油浴搅拌反应lh，得到反应液A ； 取50ml、lmol/L的NaF溶液，加入聚四氟乙烯容器中，于50°C水浴中搅拌下将反应液A倒入NaF溶液中，反应Imin ；6000rpm离心5min,弃去上清液得沉淀；向沉淀中加水，超声波洗漆3次,7000rpm离心5min ;再将沉淀用无水乙醇超声波洗漆2次，IOOOOrpm离心5min,将得到的固体置于80°C烘箱中干燥过夜；将干燥后的固体放入马弗炉中，于500°C煅烧5h，即得到NaYF4:YbiEr荧光纳米颗粒。所述的NaYF4:Yb:Er纳米颗粒也可采用水热合成法制备，具体方法如下 分别取浓度均为 O. 2mol/L 的 Y(NO3)3 4ml、Yb (NO3) 3 O. 5ml、Er (NO3) 3 O. 1ml、EDTA-Na4ml，混合均匀并充分反应，得到反应液A ;称取NaOH O. 7g，加入到8ml油酸和12ml乙醇的混合液中，混匀，在搅拌下缓慢向混合液中注入10mL、lmol/L的NaF溶液，加注完毕后，继续搅拌至溶液呈半透明状；将反应液A倒入所述溶液中，混合均匀，陈化20-30min ;然后将混合物转移至聚四氟乙烯容器中，130-150°C油浴反应12-18h，得到的产物经过滤、洗涤、干燥，即得到NaYF4:Yb:Er荧光纳米颗粒。所述免疫层析试纸条的制备方法，其特征是该方法包括以下步骤 (1)CL单克隆抗体或多克隆抗体的制备； (2)荧光抗体的制备先制备NaYF4:Yb:Er荧光物质，所述荧光物质以NaYF4为基质、Yb3+为敏化剂，由Yb和Er共掺杂形成直径50-200nm的纳米颗粒；然后将CL单克隆抗体或多克隆抗体进行荧光标记； (3)吸附纤维层的制备吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成； (4)纤维素膜层的制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于上转换荧光纳米颗粒标记的检测克伦特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其特征在于：在纤维素膜层上设有用偶联CL的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体采用NaYF4:Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张改平，职爱民，宋春美，胡骁飞，杨继飞，赵东，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。