用于脂肪酸烷基酯的酶合成的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于制备脂肪酸烷基酯的酶批量或连续方法及用于其的体系，所述脂肪酸烷基酯用于生物燃料、食品和清洁剂工业中。所述方法利用在碱性或弱碱性含水缓冲液的存在下或在水溶液的存在下，与脂肪酸源和醇或醇给体混合的固定于疏水性树脂上的酶。用于脂肪酸烷基酯的制备方法通过酯交换或酯化同时或连续进行。生物催化剂活性得以保持，而在多个用途中无显著的活性损失，还避免了甘油和水副产物或其他亲水性化合物在所述生物催化剂上的积聚。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于脂肪酸烷基酯的酶合成的方法
本专利技术公开了一种用于制备脂肪酸烷基酯的酶方法，所述脂肪酸烷基酯用于生物燃料、食品和清洁剂工业中。在所述方法中，脂肪酸源和醇或醇给体在固定于疏水性树脂上的酶的存在下，在碱性含水缓冲液或水的存在下反应。所公开的方法可使用连续搅拌槽反应器或填充床柱反应器批量地或连续地进行操作。
技术介绍
酶的固定化已由大量技术进行描述，所述大量技术基本上旨在降低在整个酶方法中酶的成本贡献、促进酶从产物中回收，以及使方法能够连续操作。固定化技术通常根据如下划分：1.酶对固体载体（如二氧化硅和不可溶聚合物）的物理吸附。2.在离子交换树脂上的吸附。3.酶对固体载体材料（如环氧化的无机或聚合物载体）的共价结合。4.酶在增长中的聚合物中的捕获。5.酶在膜反应器中或在半渗透凝胶中的限制。6.交联酶晶体（CLECS）或聚集体（CLEAS）。所有前述酶固定化程序均由如下步骤组成：1.关于pH、温度、缓冲盐的类型和离子强度，将酶溶解于适当的缓冲液体系中。2.将固体载体加入至酶溶液中，并混合一定时间直至酶分子固定至固体载体上。3.过滤含有固定化酶的固体载体。4.用适当的缓冲液洗涤所述载体以去除松散结合的酶分子，然后干燥所述固体载体。界面酶，主要是脂肪酶已遵循前述技术而被固定。这些提供了具有低合成活性和/或短的操作半衰期的固定化酶制剂。为了增加固定化脂肪酶和其他界面酶的合成活性和稳定性，已应用了不同的活化方法。这些方法包括：1.将酶的表面官能团与疏水性残基（如脂肪酸或聚乙二醇）结合。2.用表面活性剂（如多元醇脂肪酸酯）涂布酶的表面。3.使酶接触疏水性载体（通常为聚丙烯），所述疏水性载体已用亲水性试剂（如乙醇或异丙醇）进行预处理。上述方法都不产生用以进行工业量的酶反向转化的关于固定化界面酶的稳定和成本效益的令人满意的结果。而且，已报道当根据前述程序进行固定化时，由于由固定化程序所施加的某些限制，或者由于某些酶抑制剂在反应介质中的存在，大多数酶或者损失显著部分的它们的合成活性，或者它们不显示它们的完全活性性能。脂肪酶和磷脂酶的另一主要缺点在于它们对亲水性底物，特别是短链醇和短链脂肪酸（C4以下）的低耐受性。已在许多研究中观察到短链醇和短链脂肪酸（分别例如甲醇和乙酸）是使必要的水分子从那些酶的四级结构分离，从而导致酶的变性和因此它们的催化活性的损失的原因。该缺点已阻止了脂肪酶用于使用油甘油三酯和甲醇作为底物来制备商业量的脂肪酸甲酯“生物柴油”的应用。使用固定化脂肪酶用于脂肪酸源与游离醇的酯交换/酯化的另一缺点在于，所形成的甘油和水副产物在生物催化剂上积聚，因此阻止了底物自由到达固定化酶的活性位点。当使用同一批次的生物催化剂时，这些生物催化剂通常在数个循环之后损失它们的催化性能。本专利技术人已开发了在许多制备循环内显示出良好的稳定性、持久的活性的特定固定化酶制剂。这种酶制剂的例子尤其公开于WO/2008/084470、WO/2008/139455和WO2009/069116中。催化反应进行的条件可不利地影响固定化酶制剂的稳定性和效率。重要的是具有在反应条件下保留稳定性和活性的酶制剂。随着描述的进行，本专利技术的这些目的和其他目的将变得显而易见。
技术实现思路
在一个实施例中，本专利技术涉及一种用于脂肪酸源与醇的酯交换/酯化以形成脂肪酸烷基酯的方法，其包括在固定化脂肪酶制剂的存在下使脂肪酸源与醇或醇给体反应，其中所述固定化脂肪酶制剂包含至少一种固定至疏水性多孔载体上的脂肪酶，且反应介质含有含水碱性缓冲溶液。所述含水碱性缓冲溶液可为含水弱碱性缓冲溶液。所述含水碱性缓冲溶液可以所述脂肪酸源的至多5重量%的量包含于所述反应混合物中。所述含水缓冲溶液可具有7至约11，例如7-8.5、7-9、7-9.5、7-10和7-11中的任一种的pH。包含所述缓冲溶液的补充弱碱性试剂的pKa高于或等于包含所述脂肪酸源的酸的pKa。在另一实施例中，本专利技术涉及一种用于脂肪酸源与醇的酯交换/酯化以形成脂肪酸烷基酯的方法，其包括在固定化脂肪酶制剂的存在下使脂肪酸源与醇反应，其中所述固定化脂肪酶制剂包含至少一种固定至疏水性多孔载体上的脂肪酶，且反应介质含有水。所述水为具有3至11的pH的水溶液的形式。所述反应介质可含有脂肪酸源的至多5重量%的水或水溶液。在本专利技术的所有实施例和方面中，所述醇可为短链醇，例如C1-C6烷基醇，更特别地C1-C4烷基醇，特别是甲醇或乙醇。当所述醇为甲醇时，所述所得脂肪酸酯为脂肪酸甲酯（FAME-生物柴油）。所述醇也可为中链脂肪醇（C6-C10）或长链脂肪醇（C12-C22）。所述醇给体可为单烷基酯或碳酸二烷基酯，如碳酸二甲酯或碳酸二乙酯。在本专利技术的所有实施例和方面中，所述固定化脂肪酶能够催化游离脂肪酸的酯化以产生脂肪酸烷基酯以及水作为副产物，并能够催化甘油三酯和部分甘油酯的酯交换以产生脂肪酸烷基酯以及甘油作为副产物。在涉及使用碱性缓冲液或碱性溶液的本专利技术的所有实施例和方面中，在反应介质中所述碱性缓冲液或溶液的量为脂肪酸源的0.001至5重量%。在本专利技术的所有实施例和方面中，所述至少一种脂肪酶可为衍生自任一如下的脂肪酶：米赫根毛霉、假单胞菌属、雪白根霉、爪哇毛霉、米根霉、黑曲霉、卡门柏青霉、产碱杆菌属、无色杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、绵毛嗜热丝孢菌、粘稠色杆菌、南极假丝酵母B、皱褶假丝酵母、南极假丝酵母A、番木瓜种子和胰液素。所述脂肪酶制剂可包含至少两种脂肪酶，所述至少两种脂肪酶可各自分别固定至疏水性载体上，或者共固定至同一疏水性载体上。所述脂肪酶可具有相同或不同的区域专一性。所述脂肪酶能够同时或连续催化游离脂肪酸的酯化以产生脂肪酸烷基酯以及水作为副产物，以及甘油三酯和部分甘油酯的酯交换以产生脂肪酸烷基酯以及甘油作为副产物。在本专利技术的所有实施例和方面中，所述载体可为疏水性脂族聚合物基载体和疏水性芳族聚合物基载体中的任一种。所述疏水性聚合物载体可由直链或支链有机链组成。所述载体可包含大网络有机聚合物或共聚物链。所述载体可为多孔或非多孔无机载体，所述多孔或非多孔无机载体可为疏水性的，或用疏水性有机材料涂布。所述有机材料可为直链、支链或官能化的疏水性有机链。在本专利技术的所有实施例和方面中，当使用碱性缓冲溶液时，所述含水碱性缓冲溶液可为无机碱盐或有机碱的溶液。所述碱性缓冲溶液可为如下任一种的溶液和它们的任意混合物：碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐和柠檬酸盐、伯胺、仲胺和叔胺。在特定实施例中，所述碱性缓冲溶液可为选自钠或钾的碳酸氢盐和碳酸盐的弱碱的溶液。在本专利技术的方法的一些特定实施例中，可在预混阶段将所述碱性缓冲溶液加入至所述脂肪酸源，或者将所述碱性缓冲溶液直接加入至所述反应介质。在本专利技术的所有实施例和方面中，当使用碱性缓冲溶液时，在酯交换/酯化反应介质中的所述碱性缓冲溶液的含量可在油原料的0.001-5重量%范围内，例如油原料的1-2重量%。在本专利技术的一些实施例中，所述脂肪酸源可首先与所述碱性缓冲溶液或者与水或水溶液混合，然后用所述固定化脂肪酶制剂处理所述混合物，随后加入所述醇，并允许反应在合适的条件下进行直至所述脂肪酸源转化为脂肪酸酯。在本专利技术的所有实施例和方面中，所述脂肪酸源可为如下的任一种和它们的任意混合物：植物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.01 US 61/309,1221.一种用于脂肪酸源与醇的酯交换和/或酯化以形成脂肪酸烷基酯的方法，其包括在固定化脂肪酶制剂的存在下使所述脂肪酸源与醇或醇给体反应，其中所述固定化脂肪酶制剂包含一种固定在疏水性多孔载体上的脂肪酶，且反应介质含有含水碱性缓冲溶液，所述含水碱性缓冲溶液在所述脂肪酸源的至多5重量％的量下具有7-11的pH，其中，所述脂肪酸源包括在不存在或存在游离脂肪酸或其选自酰胺、酯、磷脂和固醇酯的衍生物下的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、它们任意比例的混合物，其中，所述酯交换和/或酯化同时或连续进行，其中，甘油和/或水分别作为副产物形成。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含水碱性缓冲溶液为含水弱碱性缓冲溶液。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述含水碱性缓冲溶液以所述脂肪酸源的0.5重量％、0.75重量％、1重量％、1.5重量％、2重量％、2.5重量％、3重量％、3.5重量％、4重量％、4.5重量％或5重量％的量被包含。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述pH为7-8.5、7-9、7-9.5和7-10中任一种。5.一种用于选自甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯及其任意的混合物的脂肪酸源与醇或醇给体的酯交换和/或酯化以形成脂肪酸烷基酯的方法，所述酯交换/酯化在不存在或存在游离脂肪酸或其选自酰胺、酯、磷脂和固醇酯的衍生物下进行，所述方法包括在固定化脂肪酶制剂的存在下使所述脂肪酸源与醇反应，其中所述固定化脂肪酶制剂包含固定在疏水性多孔载体上的脂肪酶，且所述脂肪酸源或者反应介质中以所述脂肪酸源的至多5重量％的量添加了水或水溶液，其中水溶液或反应体系的pH为3-11，并且其中，所述酯交换和/或酯化同时或连续进行，其中，甘油和/或水分别作为副产物形成。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述反应介质含有所述脂肪酸源的0.5重量％、0.75重量％、1重量％、1.5重量％、2重量％、2.5重量％、3重量％、3.5重量％、4重量％、4.5重量％或5重量％的水或水溶液。7.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述醇为短链醇。8.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述醇给体为单烷基酯，或者碳酸二烷基酯，其也充当在反应介质中的弱碱性试剂源。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述单烷基酯是乙酸甲酯并且所述碳酸二烷基酯是碳酸二甲酯。10.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述至少一种脂肪酶为源自如下任一的脂肪酶：米赫根毛霉、假单胞菌属、雪白根霉、爪哇毛霉、米根霉、黑曲霉、卡门柏青霉、产碱杆菌属、无色杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、绵毛嗜热丝孢菌、粘稠色杆菌、南极假丝酵母B、皱褶假丝酵母、南极假丝酵母A和番木瓜种子。11.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述固定化脂肪酶能够催化游离脂肪酸的酯化以产生脂肪酸烷基酯以及作为副产物的水，并能够催化甘油三酯和偏甘油酯的酯交换以产生脂肪酸烷基酯以及作为副产物的甘油。12.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在反应介质中的所述碱性溶液的量为脂肪酸源的0.5至5重量％。13.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述脂肪酶制剂包含至少两种脂肪酶，所述至少两种脂肪酶可各自分别固定至疏水性载体上，或者共固定至同一疏水性载体上。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述脂肪酶具有相同或不同的区域专一性。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述脂肪酶能够同时或连续催化游离脂肪酸的酯化以产生脂肪酸烷基酯以及作为副产物的水，以及甘油三酯和偏甘油酯的酯交换以产生脂肪酸烷基酯以及作为副产物的甘油。16.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述载体为疏水性脂族聚合物基载体和疏水性芳族聚合物基载体中的任一种。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述疏水性聚合物载体由直链或支链的有机链组成。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述载体包含大网络有机聚合物或共聚物链。19.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述载体为多孔无机载体，所述多孔或非多孔无机载体可为疏水性的或用疏水性有机材料涂布。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述有机材料为直链、支链或官能化的疏水性有机链。21.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述含水碱性缓冲溶液为无机碱性盐或有机碱的溶液。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述碱性缓冲溶液为如下任一种的溶液及它们的任意混合物：碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐和柠檬酸盐、伯胺、仲胺和叔胺。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述碱性缓冲溶液为选自钠或钾的碳酸氢盐和碳酸盐的弱碱的溶液。24.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在预混阶段将所述碱性缓冲溶液加入至所述脂肪酸源，或者将所述碱性缓冲溶液直接加入至所述反应介质。25.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在酯交换/酯化反应介质中的所述碱性缓冲溶液的含量在油原料的0.5-5重量％范围内。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述碱性缓冲溶液的含量为油原料的1-2重量％。27.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述脂肪酸源首先与所述碱性缓冲溶液混合，然后用所述固定化脂肪酶制剂处理所述混合物，随后加入所述醇，并允许反应在合适的条件下进行直至将所述脂肪酸源转化为脂肪酸酯。28.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述脂肪酸源为如下的任一种和它们的任意混合物：植物油、动物脂肪、海藻油、鱼油、废油、褐色润滑脂。29.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述脂肪酸源包括在不存在或存在选自磷脂和固醇酯的其他少量脂肪酸衍生物下的游离脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯、它们任意比例的混合物、脂肪酸酯和酰胺，所述其他少量脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸源为未精制的、精制的、漂白的、除臭的或它们的任意组合。30.根据权利要求5所述的方法，其中所述脂肪酸源进一步包括脂肪酸酯和酰胺，以及选自磷脂和固醇酯的其他少量脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸源为未精制的、精制的、漂白的、除臭的或它们的任意组合。31.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述醇为短链烷基醇。32.根据权利要求31的所述方法，其中所述短链烷基醇为C1-C6烷基醇。33.根据权利要求31的所述方法，其中所述短链烷基醇为C1-C4烷基醇。34.根据权利要求31的所述方法，其中所述短链烷基醇为甲醇或乙醇。35.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述醇为甲醇，且所述所得脂肪酸酯为脂肪酸甲酯。36.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述醇为6-10个碳原子的中链脂肪醇或12-22个碳原子的长链脂肪醇。37.根据权利要求1或权利要求5所述的方法，其中所述反应在10℃至100...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·巴舍尔，M·哈伊，U·莫森，D·舍哈德，A·辛达维，E·玛索德，
申请(专利权)人：转换生物柴油有限公司，
类型：发明
国别省市：