甘油酯形式的n-3脂肪酸的酶促富集制造技术

公开用于使油富含ω‑3脂肪酸的各种酶促方法，以及用于这些方法的特定脂肪酶制剂。

Enzymatic Enrichment of n-3 Fatty Acids in Glyceride Form

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】甘油酯形式的n-3脂肪酸的酶促富集
公开了包含甘油酯的物质组合物，该甘油酯富含n-3脂肪酸结构部分、特别是EPA和DHA。还公开了用于制备所公开的物质组合物的酶促方法，其可以是用于生产富含n-3多不饱和脂肪酸的甘油酯的一锅法或多步骤多酶促催化反应。现有技术以下提及的参考文献被认为作为
技术介绍
与本专利技术所公开主题相关。还参考以上所列出版物中提及的出版物的全部。认可本文中以上参考文献不应推断为表示其以任何方式与本专利技术所公开主题的可专利性相关。专利技术背景概要多不饱和脂肪酸(PUFA)代表一族含有两个或更多个双键的长链脂肪酸。PUFA细分为两个主要的组；n-3(ω-3或Omega-3)脂肪酸和n-6(ω-3或Omega-6)脂肪酸。n-3脂肪酸组包括必需脂肪酸α-亚麻酸(ALA，18:3n-3)及其长链代谢物，即EPA(二十碳五烯酸)、DHA(二十二碳六烯酸)和DPA(二十二碳五烯酸)，而n-6脂肪酸组尤其包括花生四烯酸(ARA)和亚油酸。ω-3脂肪酸存在于整个动物和植物界。微生物、特别是藻类、真菌和细菌被认为是最富含这类脂肪酸的物质。这些脂肪酸典型地以酯、磷脂、醚、糖脂、鞘脂和脂蛋白的脂肪酰基形式存在于储存油甘油三酯以及膜脂中。将PUFA结构部分引入甘油三酯中是储存这些脂肪酸的最有利形式，因为游离脂肪酸和短脂肪酸烷基酯如脂肪酸乙酯更容易氧化和降解。同样，将脂肪酸结构部分引入甘油三酯中是有利的，因为其容易水解成其游离形式，其当用在食品、营养品和药物中时容易在消化系统中吸收[Christensen，M.S.等，Am.J.Clin.Nutr.1995，61:56]。n-3脂肪酸的富集和分离方法已经分别或组合地应用不同方法来从天然存在的源中浓缩、分离和回收n-3脂肪酸及其衍生物(甲基或乙基酯、甘油三酯和酰胺)。这些方法主要包括低温下分步结晶、分子蒸馏、尿素络合物结晶、固定床色谱法以及使用脂肪酶。这些富集方法通常利用脂肪酸的不饱和度以及碳链长度，二者都导致在不同溶剂中的溶解度、结晶、熔点和蒸发点、极性和化学反应性方面表现出不同的物理和化学特性。通过脂肪酶催化的反应来富集n-3脂肪酸脂肪酶被定义为水解酶，其作用于水性体系中三酰甘油分子中的酯键以得到游离脂肪酸、偏甘油酯和甘油。在微水性有机体系中，该族的酶能够催化逆水解反应[Medina，A.R.等，J.Biotechnology，1999，70：379；Shimada，Y.等，J.Biosci.Bioeng.，2001，91(6)：529]。通常，脂肪酶根据其区域特异性分为两类，即随机脂肪酶和1,3-位特异性脂肪酶。在许多情况中，脂肪酶显露出与脂肪酸的饱和度、脂肪酰基基团的链长、脂肪酸碳链上双键的位置以及碳链上双键的几何形状(顺式/反式)相关的不同底物活性。脂肪酶催化的含PUFA油的水解某些脂肪酶表达出对甘油三酯底物的脂肪酸残基类型的选择性。例如衍生自皱褶假丝酵母(Candidarugosa)和柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶是已知的对甘油三酯中饱和以及单不饱和脂肪酸残基具有高选择性的酶。在这样的方法中，在达到一定的油水解度之后，使有机层和水性层分离。其后，有机相中的游离脂肪酸通过分子蒸馏除去，产生了甘油酯形式的n-3脂肪酸的浓缩物[美国专利申请2004/0033571A1]。据报道借助于衍生自柱状假丝酵母的脂肪酶水解金枪鱼油产生了含有44.1％n-3脂肪酸(18.5％EPA、17.3％DHA和3.62％DPA)的甘油酯混合物。为了获得更高含量的n-3脂肪酸如最高70％的n-3脂肪酸，可以对第一级中获得的浓缩物应用利用脂肪酶的第二级水解。还报道了多级水解可以降低n-3脂肪酸的回收率。脂肪酶催化的游离脂肪酸的选择性酯化在各种游离脂肪酸的混合物与醇的酯化反应中，已经确认一些脂肪酶对于脂肪酸的类型具有不同的特异性。这样的过程以两级进行，或是化学地(例如用苛性钠)或是用随机和非选择性脂肪酶水解所述油以获得游离脂肪酸，并且用短链醇使用偏好于某些类型的脂肪酸的脂肪酶选择性酯化第一级中获得的游离脂肪酸[Shimada，Y.等，(2001)ibid.；美国专利号6159523]。这种类型的两级酶促过程已经用于富集n-3脂肪酸以及富集单个脂肪酸。例如通过化学或酶水解所获得的含有EPA(14％)和DHA(15％)的游离脂肪酸水解物用乙醇直接酯化，以得到EPA和DHA乙基酯。该反应典型地由对饱和的、单不饱和以及双不饱和脂肪酸具有高选择性和对EPA具有一定程度的选择性的脂肪酶如米黑毛霉(mucormiehei)脂肪酶(MML)来催化。反应可以例如当游离脂肪酸到脂肪酸乙酯的转化率达到约70％时停止，并且未酯化的脂肪酸通常含有更高浓度的DHA。依照这种方法，获得了n-3脂肪酸浓缩物，其含有49％的DHA和6％的EPA，回收率分别是73％和10％[Watanabe，Y.等，J.BioscienceandBioengineering。1999，88(6)：622；US2006/0148047A1]。脂肪酶催化的含PUFA油的醇解某些脂肪酶在有机介质中具有醇解活性。在这种类型的反应中，甘油三酯与乙醇或其他短链醇或脂肪酸酯与中链脂肪醇(如正己醇)直接反应。潜在地用于这类反应的脂肪酶是对某些类型的脂肪酸或脂肪酰基具有选择性的那些[Watanabe等ibid.；US2005/0233427，US2006/0148047；Shimada等ibid.]。两种方案通常用于通过醇解反应来富集n-3脂肪酸：a.两级醇解反应，其中在第一级中，用碱性催化剂或用非特异性脂肪酶进行鱼油甘油三酯的完全醇解以产生鱼油脂肪酸乙基酯。该反应典型地由衍生自南极假丝酵母B的脂肪酶来催化。在第二级中，使用对n-3脂肪酸具有低选择性的脂肪酶如米黑根毛霉脂肪酶使所得到的鱼油脂肪酸乙酯与长链醇如正己醇进行酯交换，以形成具有低n-3脂肪酰基含量的脂肪酸己酯和具有高n-3脂肪酰基含量的未反应的脂肪酸乙酯。该反应混合物可以用分馏处理以获得富含n-3脂肪酸乙酯的馏分。该富含n-3脂肪酸的脂肪酸乙酯馏分可以使用Novozym435(固定化的南极假丝酵母脂肪酶B，Novozymes，丹麦)作为催化剂在真空下并且加热直到65℃用甘油进行酯交换，以形成富含n-3脂肪酸的甘油三酯。b.使用对n-3脂肪酸酰基基团具有低选择性的脂肪酶用短链醇(如乙醇)进行鱼油的一级醇解反应，以形成富含n-3脂肪酸的甘油酯和作为酯交换反应副产物的具有低n-3脂肪酸含量的脂肪酸烷基酯。该过程通常典型地产生n-3脂肪酸为40-60％的甘油酯，且n-3脂肪酸的回收率典型地为50-70％，同时余量的n-3脂肪酸出现在副产物中。脂肪酶催化的含PUFA油的酸解反应研究工作已经描述了脂肪酶催化的植物油和富含n-3脂肪酸(主要是游离脂肪酸或其乙基酯)的源的酯交换。衍生自米黑根毛霉(LipozymeRMIM，由Novozymes制造)的脂肪酶是常用于这些研究的酶。由于这种酶表现出1,3-位活性，因此在最终产物中能够实现最高66％的PUFA含量[Jennings，B.和Akoh，C.C.，J.Am.Oil.Chem.Soc.1999，76(10)：1133]。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于富集作为甘油酯的n‑3多不饱和脂肪酸(n‑3 PUFA)的酶促方法，所述方法包括：(a)提供n‑3 PUFA结构部分的含量是约5％至约60％w/w的油，该n‑3 PUFA结构部分作为游离酸或所述油中所含的甘油酯和/或极性类脂的酰基而存在；(b)以所述油的0.2‑10％w/w的量向所述油中加入水或碱性缓冲水溶液，以得到pH为约5至约9的混合物；(c)向步骤(b)中获得的混合物中加入脂肪酶，其中所述脂肪酶固定在合适的聚合物载体上，其中所述脂肪酶表现出对饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸或其脂肪酰基的高选择性，并且能够同时或连续地酯交换、水解和/或酯化所述油；(d)提供烷基醇或醇给体、特别是短链烷基醇或醇给体，和将所述醇或醇给体加入、特别是逐步加入步骤(c)中获得的所述油和所述酶制剂的混合物中，以形成包含所述油、所述脂肪酶制剂、所述水或碱性缓冲水溶液和所述醇的反应体系，其中所述油与所述醇反应，并且使得所述反应达到至少40％的所述油到脂肪酸烷基酯(FAEE)的转化率，低于10％游离脂肪酸(FFA)和约15％至约60％甘油酯，基于反应体系中所用油的重量计；(e)通过从所述反应体系中除去所述反应介质来停止反应，随后蒸发、特别是闪蒸以除去多余的醇和水，以得到包含单甘油酯、双甘油酯和三甘油酯的混合物和FAEE、FFA以及任选的极性类脂的产物；和(f)通过从步骤(e)中获得的产物中蒸馏出所述脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸来使所述甘油酯与所述FAEE和FFA分离，以得到包含FAEE和FFA的馏出物和包含甘油酯混合物和任选的极性类脂的残留物，其中所述混合物含有比所述油更高的ω‑3脂肪酸含量，且回收率高于60％。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.19 US 62/436,0781.一种用于富集作为甘油酯的n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFA)的酶促方法，所述方法包括：(a)提供n-3PUFA结构部分的含量是约5％至约60％w/w的油，该n-3PUFA结构部分作为游离酸或所述油中所含的甘油酯和/或极性类脂的酰基而存在；(b)以所述油的0.2-10％w/w的量向所述油中加入水或碱性缓冲水溶液，以得到pH为约5至约9的混合物；(c)向步骤(b)中获得的混合物中加入脂肪酶，其中所述脂肪酶固定在合适的聚合物载体上，其中所述脂肪酶表现出对饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸或其脂肪酰基的高选择性，并且能够同时或连续地酯交换、水解和/或酯化所述油；(d)提供烷基醇或醇给体、特别是短链烷基醇或醇给体，和将所述醇或醇给体加入、特别是逐步加入步骤(c)中获得的所述油和所述酶制剂的混合物中，以形成包含所述油、所述脂肪酶制剂、所述水或碱性缓冲水溶液和所述醇的反应体系，其中所述油与所述醇反应，并且使得所述反应达到至少40％的所述油到脂肪酸烷基酯(FAEE)的转化率，低于10％游离脂肪酸(FFA)和约15％至约60％甘油酯，基于反应体系中所用油的重量计；(e)通过从所述反应体系中除去所述反应介质来停止反应，随后蒸发、特别是闪蒸以除去多余的醇和水，以得到包含单甘油酯、双甘油酯和三甘油酯的混合物和FAEE、FFA以及任选的极性类脂的产物；和(f)通过从步骤(e)中获得的产物中蒸馏出所述脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸来使所述甘油酯与所述FAEE和FFA分离，以得到包含FAEE和FFA的馏出物和包含甘油酯混合物和任选的极性类脂的残留物，其中所述混合物含有比所述油更高的ω-3脂肪酸含量，且回收率高于60％。2.根据权利要求1的方法，其中从反应产物蒸馏出的所述脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸的混合物包含低于所述油中存在的总n-3脂肪酸的40％的n-3脂肪酸结构部分。3.根据权利要求1和2中任一项的方法，其中所述醇是乙醇或甲醇中的任何之一，和所述短烷基醇给体是碳酸二甲酯或碳酸二乙酯中的任何之一的醇给体。4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蒸馏是分子蒸馏、短程蒸馏或薄膜蒸馏中的任何之一。5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述n-3脂肪酸结构部分是DHA、DPA和EPA结构部分中的任何之一及其至少两种的任何混合物。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂肪酶衍生自以下中的任何之一：南极假丝酵母A(CandidaantarcticaA)(CALA)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、南极假丝酵母B(CandidaantarcticaB)(CALB)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡门柏青霉(Penicilliumcamembertii)、产碱杆菌属(Alcaligenessp.)、伯克霍尔德菌属(Burkholderiasp.)、绵毛嗜热丝胞菌(Thermomyceslanuginose)或粘质色杆菌(Chromobacteriumviscosum)、特别是其中所述脂肪酶衍生自南极假丝酵母A(CALA)、假单胞菌属、产碱杆菌属或绵毛嗜热丝胞菌。7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述脂肪酶固定在疏水性多孔聚合物树脂载体、特别是疏水性脂族或芳族树脂载体上，特定的疏水性芳族树脂是交联的二乙烯基苯(DVB)或苯乙烯或交联的苯乙烯-DVB。8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中步骤(f)中获得的所述甘油酯混合物进一步与反应混合物中(i)n-3FFA浓缩物或(ii)n-3脂肪酸短链烷基酯浓缩物中的至少之一在游离形式或固定在聚合物树脂载体上的合适脂肪酶、特别是衍生自南极假丝酵母B(CALB)的脂肪酶的存在下，在真空和30-80℃的温度下反应，以得到甘油酯混合物，并且在从反应混合物中蒸馏多余的脂肪酸乙酯和/或脂肪酸、以及副产物醇和/或水之后，大于60％的甘油三酯含有大于60％的n-3脂肪酸。9.根据权利要求1-8中任一项的方法，所述油是可食用油、特别是鱼油或藻类油、真菌油或含有n-3脂肪酸的合适的含油物质。10.一种用于制备甘油酯混合物的方法，所述甘油酯具有约30％至约80％w/w、特别是约50％-80％w/w、更特别是约50％-70％w/w的n-3多不饱和脂肪酸结构部分，所述方法包括：(a)提供油，其包含n-3多不饱和脂肪酸、特别是约5％至约60％w/w的n-3多不饱和脂肪酸，所述n-3脂肪酸作为键合到所述油中的甘油酯或极性类脂的甘油主链上的脂肪酰基和/或作为游离脂肪酸而存在，所述油还包含游离或酯化的饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸；(b)以所述油的0.2-10％w/w的量向所述油中加入水或碱性缓冲水溶液，以得到pH为约5至约9的混合物；(c)向步骤(b)中获得的混合物中加入脂肪酶，其中所述脂肪酶固定在聚合物树脂载体上，其中所述树脂包含交替的疏水性结构域和温和亲水性结构域，特别是包含疏水性脂族或芳族单体的疏水性结构域和包含丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯的温和亲水性结构域，其中所述脂肪酶表现出对饱和脂肪酸、单不饱和、双不饱和以及三不饱和脂肪酸或其脂肪酰基的高选择性，并且能够同时或连续地酯交换、水解和/或酯化所述油；(d)提供烷基醇或醇给体、特别是短链烷基醇或醇给体，并且将所述醇或醇给体加入、特别是逐步加入步骤(c)中获得的所述油和所述酶制剂的混合物中，以形成包含所述油、所述水或碱性缓冲水溶液、所述脂肪酶制剂和所述醇的反应体系，其中所述油与所述醇反应，并且使得所述反应达到至少40％的所述油到脂肪酸烷基酯(FAEE)的转化率，低于10％游离脂肪酸(FFA)和约15％至约60％甘油酯，基于反应体系中所用油的重量计；(e)通过从所述反应体系中除去所述反应介质来停止反应，随后蒸发、特别是闪蒸所述反应物以除去多余的醇和水，以得到包含单甘油酯、双甘油酯和三甘油酯的混合物和FAEE、FFA以及任选的极性类脂的产物；和(f)通过从步骤(e)中获得的产物中蒸馏出所述脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸来使所述甘油酯混合物与所述FAEE和FFA分离，以得到包含FAEE和FFA的馏出物，和包含甘油酯混合物的残留物，其中所述甘油酯混合物任选地进一步包含极性类脂，所述甘油酯混合物含有比所述油更高的ω-3脂肪酸含量，且回收率高于60％。11.根据权利要求10的方法，所述油是可食用油，特别是鱼油或藻类油、真菌油或含有n-3脂肪酸的合适的含油物质。12.根据权利要求10或权利要求11的方法，其中从反应产物蒸馏出的所述脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸的混合物包含低于进料中存在的总n-3脂肪酸的40％的n-3脂肪酸结构部分。13.根据权利要求10-12中任一项的方法，其中所述醇是乙醇或甲醇中的任何之一，和所述短烷基醇给体是碳酸二甲酯或碳酸二乙酯中任何之一的醇给体。14.根据权利要求10-13中任一项的方法，其中所述蒸馏是分子蒸馏、短程蒸馏或薄膜蒸馏中的任何之一。15.根据权利要求10-14中任一项的方法，其中所述n-3脂肪酸结构部分是DHA、DPA和EPA结构部分中的任何之一及其至少两种的任何混合物。16.根据权利要求10-15中任一项的方法，其中所述脂肪酶衍生自以下中的任何之一：南极假丝酵母A(CALA)、米黑根毛霉、假单胞菌属、雪白根霉、爪哇毛霉、米根霉、南极假丝酵母B(CALB)、黑曲霉、卡门柏青霉、产碱杆菌属、伯克霍尔德菌属、绵毛嗜热丝胞菌或粘质色杆菌、特别是其中所述脂肪酶衍生自南极假丝酵母A(CALA)、假单胞菌属、产碱杆菌属或绵毛嗜热丝胞菌。17.根据权利要求10-16中任一项的方法，其中所述疏水性芳族单体是二乙烯基苯(DVB)和/或苯乙烯，和其中任选的所述温和亲水性单体是丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯、或组合的丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯。18.根据权利要求10-17中任一项的方法，其中所述疏水性树脂结构域和所述温和亲水性结构域之间的重量比分别是约10:0.1至约1:10。19.根据权利要求10-18中任一项的方法，其中步骤(f)中获得的所述甘油酯混合物与反应混合物中(i)n-3游离脂肪酸浓缩物或(ii)n-3脂肪酸短链烷基酯浓缩物中的至少之一在游离形式或固定在聚合物树脂载体上的合适的脂肪酶、特别是衍生自南极假丝酵母B(CALB)的脂肪酶的存在下反应以得到甘油酯混合物，并且在从反应混合物中蒸馏多余的脂肪酸乙酯和/或脂肪酸以及副产物醇和/或水之后，大于60％的甘油三酯含有大于60％的n-3脂肪酸。20.一种用于酶促制备n-3脂肪酸短链烷基酯、特别是n-3脂肪酸乙酯的方法，其包括：(a)提供油，其包含n-3多不饱和脂肪酸、特别是约5％至约60％w/w的n-3多不饱和脂肪酸，所述n-3脂肪酸作为键合到所述油中的甘油酯和任选的极性类脂的甘油主链上的脂肪酰基和/或作为游离脂肪酸而存在，所述油还包含游离或酯化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·巴舍，A·埃格巴尔埃，R·马斯里，
申请(专利权)人：转换生物柴油有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL