本发明专利技术提供了一种来源于野萝卜的脂肪酸延长酶及其编码基因RrFAE1。将该基因导入酵母，重组酵母芥酸含量达0.75±0.17％。本发明专利技术的蛋白及其编码基因对于植物芥酸遗传调控机制的研究以及提高植物的芥酸含量和相关性状的改良具有重要的理论和实际意义，将在植物的芥酸基因基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，更具体地，涉及野萝卜 (Raphanusraphanistrum L.)脂肪酸延长酶(FAEl)及其编码基因。
技术介绍
芥酸(erucic acid，C22:1)是一种超长链不饱和脂肪酸，主要存在于十字花科 (Brassicaceae)和金莲花科(Tropaeolaceae)植物种子中。作为植物的代谢产物，芥酸还在一定程度上影响植物的生长发育，在植物与环境的相互作用中，参与了生物膜角质或蜡质的合成。从营养价值来说，芥酸是食用油的抗营养成分，不易被人体消化吸收，容易导致冠心病和脂肪肝等病害发生。然而，在工业上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有较好的增塑性和疏水性，因此，具有广泛的用途，是生产润滑剂、防腐剂、化纤原料和化妆品等化工产品的重要原料。FAEl (Fatty Acid Elongase I)基因是调控芥酸合成的关键基因，虽然自James等最先从拟南芥中克隆到FAEl基因以来，陆续有完整的FAEl基因从各种十字花科植物中被分离出来，但目前对于FAEl基因的克隆仅局限于拟南芥及芸苔属少数几种植物中，而十字花科是芥酸分布的主要种质资源，植物种类多，芥酸含量复杂，是FAEl基因克隆的合适材料。本专利技术通过RrFAEl基因的真核表达，获得活性蛋白，同时脂肪酸含量检测分析发现该基因所编码的蛋白对芥酸合成有催化活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来自于芥酸含量较高的野萝卜中的脂肪酸延长酶 (Fatty Acid Elongase I, FAE1)及其编码基因。本专利技术的野萝卜的FAEl基因由1251个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框，为序列表中的I号序列，将此基因命名为RrFAEl。本专利技术的野萝卜FAEl蛋白由506个氨基酸组成，开放阅读框的起始密码子为ATG， 终止密码子为TAA。RrFAEl蛋白的理论分子量为56. 24kDa，等电点为9. 42。含有上述序列I及其开放阅读框架的多核苷酸的载体，以及用上述序列I及其开放阅读框架的多核苷酸转化的生物细胞，均是本专利技术需要保护的内容。本专利技术基因的发现，使通过转基因来调控芥酸合成成为可能，对于培育高芥酸的转基因十字花科作物具有重要意义。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。附图说明图I为野萝卜基因组DNA图2为RrFAEl基因全长PCR扩增产物图3为真核表达载体PYES-RrFAEl的构建流程图图4为载体pYES-RrFAEl的酶切图谱图5为酵母中RrFAEl表达产物的Western Blot分析具体实施方式实施例I、基因RrFAE I的克隆克隆RrFAEl，具体步骤如下一、RrFAEl基因的获得野萝卜在正常条件下栽培，待真叶长出，采集叶片，从叶片中提取DNA，进行聚合酶链式反应，最终获得RrFAEl基因。I、野萝卜基因组DNA的提取取新鲜幼嫩的活体植物叶片约O. 2g，在液氮冷冻条件下充分研磨，转入I. 5mL的离心管中，加入500 μ L CTAB提取液，65°C水浴45min，期间颠倒混匀3次；加入500 μ L体积比为24 I的氯仿-异戊醇，混合均匀，12000r · HiirT1离心15min ;取上清，加2倍体积无水乙醇，_20°C冰箱中过夜；4000r · mirT1离心15min使DNA沉淀；700 μ L 70%乙醇清洗 2 次，4000r · mirT1 离心 IOmin,再用 700 μ L 无水乙醇清洗 I 次，4000r · mirT1 离心 IOmin, 得DNA沉淀晾干；最后加100 μ L去离子水使沉淀溶解。电泳检测结果如图I所示。2、聚合酶链式反应PCR以上述得到的野萝卜基因组DNA为模版，以分别带有KpnI与BamHI酶切位点的T FK (5 ' CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC 3 ')与 TRB(5' CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC)为引物，按以下反应扩增出RrFAEl基因。反应体系如下DNA 模版1.0μ1(2·0μ§)IO X PCR Buffer (含 Mg2+) 2.0 μ dNTP0.3 μ (10 mM each)引物 TFGpmoH1)引物 TR^pmoH1) ExTaq DNA polymerase2.0 μ 2.0 μ 0.2 μ (5 U/μΙ)ddH2012.5 μ 按以下程序进行扩增反应 先94°C预变性3min ;然后94°C变性30sec，53°C退火 30sec，72°C延伸lmin，35个循环；最后72°C延伸5min。电泳检测PCR产物，如图2所示，有一大小约1500bp大小的条带,与理论值相符。回收1500bp的条带，将该DNA片段连接到pMD18_T载体上，生成pMD-RrFAEl重组载体，转化大肠杆菌DH5，经测序后在GenBank中进行Blastn比较，结果表明，该DNA与多种植物FAEl基因有较高的同源性，因此推测所扩增的DNA为一个FAEl基因。测序后进行 BLAST检索，结果表明已分离得野萝卜FAEl基因序列。二、RrFAEl基因的同源性分析及二级结构分析为将野萝卜的FAEl基因的蛋白序列与其他高等植物的FAEl基因编码的蛋白进行同源性分析，从NCBI网站上检索到拟南芥(Arabidopsis thaliana),芥菜(Brassica juncea),欧洲油菜(Brassica napus),花椰菜(Brassica oleracea),完青(Brassica rapa), Camelina hispida, Cardamine graeca,海甘蓝(Crambeabyssinica),蒋蓝(Isatis tinctoria),绿独行菜(Lepidium campestre),银扇草(Lunaria annua),白芥(Sinapis alba),中欧芥(Teesdalia nudicaulis)等植物同源基因的蛋白序列。通过Megalign软件分析结果表明野萝卜FAEl蛋白的氨基酸序列与欧洲油菜及白芥中FAEl蛋白的同源性达 96. 4%,与其它几种植物的同源性在80% -90%左右，与Cardamine graeca的FAEl蛋白同源性最低，仅为80.9%。Pfam结果显示RrFAEl基因所编码蛋白具有典型的FAEl蛋白特有的FAE1_CUT1_ RppA 与 ACP_syn_III_C 结构域。 实施例2、RrFAEl基因的功能验证一、RrFAE I基因在酵母中的高效表达为了表明RrFAEl基因的编码功能，本专利技术将RrFAEl基因克隆到Invitrogen公司的pYES2/NT C的BamHI和KpnI位点之间，并转化酵母菌株InvScl，获得了高效表达。本专利技术是利用Invitrogen公司的pYES2/NT C高效表达载体的多克隆位点来实现 RrFAEl的高效表达的。本实验采用的酶切位点使pYES2/NT C表达载体表达出的产物5’端附加6个连续His的融合蛋白，这6个连续的His构成了 i-NTA凝胶特异结合的位点，因此可利用亲和层析来纯化表达产物。将携带RrFAEl基因的pMD-RrFAEl重组载体与pYES2/NT C表达载体用相同的酶 (BamHI和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脂肪酸延长酶多肽，该多肽选自：(a)具有序列2氨基酸序列的多肽；(b)将序列2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的具有脂肪酸延长酶功能的多肽。
【技术特征摘要】
1.一种脂肪酸延长酶多肽，该多肽选自 (a)具有序列2氨基酸序列的多肽； (b)将序列2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的具有脂肪酸延长酶功能的多肽。2.根据权利要求I所述脂肪酸延长酶的编码基因，其特征在于所述脂肪酸延长酶的基因cDNA为下述核苷酸序列之一 (a)序列表中序列I的核苷酸序列； (b)与多核...
【专利技术属性】
技术研发人员：杭悦宇，孙小芹，庞慧，李莹，李密密，郭建林，严琴琴，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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