脂肪酸去饱和酶家族成员ＦＡＤ４、ＦＡＤ５、ＦＡＤ５－２和ＦＡＤ６及它们的应用制造技术

本发明专利技术提供分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码新型脂肪酸去饱和酶家族成员。本发明专利技术还提供包含去饱和酶核酸分子的重组表达载体、已经引入所述表达载体的宿主细胞以及大规模生产长链多不饱和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）如ＤＨＡ的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
脂肪酸去饱和酶家族成员FAD4、FAD5、FAD5-2和FAD6及它们的应用本申请是以下申请的分案申请申请日2001年9月28日；申请号 01819633. 0(PCT/IB01/02346)；专利技术名称同上。相关申请本申请要求2000年9月28日申请的美国临时申请序号60/236，303和2001年6 月12日申请的美国临时申请序号60/297，562的优先权，所述临时申请的完整内容特此通 过引用完整地结合到本文中。所述临时申请所引用的所有参考文献的完整内容也特此通过 引用结合到本文中，成为本申请的一部分。
技术介绍
脂肪酸是具有长链碳氢侧链基团的羧酸，在许多生物过程中起主要作用。脂肪酸 在自然中很少是游离的，而是作为脂类的主要成分以酯化形式存在。脂类/脂肪酸是能量 的来源(如b_氧化)，并且是加工生物学或生物化学信息不可缺少的细胞膜的组成部分。脂肪酸可以分为两类饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其中不饱和脂肪酸在顺式构 型内包含一个或多个碳双键。不包含脂肪酸由属于非血红素-铁酶家族的末端去饱和酶产 生。每种这样的酶都是电子转运系统的一部分，而电子转运系统包含两种其它蛋白，即细胞 色素b5和NADH-细胞色素b5还原酶。明确地说，所述酶催化脂肪酸分子中碳原子之间双 键的形成。人和其它哺乳动物体内催化不饱和脂肪酸中特定双键形成所需的这些去饱和 酶的种类有限。因此，人必须通过膳食摄取一些脂肪酸。所述必需脂肪酸有，例如，亚油酸 (C18:2)；亚麻酸(C18:3)、花生四烯酸(C20:4)。与此不同，昆虫和植物能够合成更多种类 的不饱和脂肪酸及它们的衍生物。长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)如二十二碳六烯酸(DHA，22:6(4，7，10，13，16， 19))是哺乳动物体内各种组织和细胞器(神经、视网膜、脑和免疫细胞)的细胞膜的必需 成分。例如，脑磷脂中超过30%的脂肪酸是22:6(n-3)和20:4(n-6)。(Crawford,M. A.等 (1997)Am. J. Clin. Nutr. 66 1032S-1041S) 在视网膜中，DHA占感光细胞的感光部分杆 外节段中总脂肪酸超过 60%。(Giusto, N. M.等(2000)Prog. Lipid Res. 39 :315_391)。 临床研究已经显示DHA对于婴儿脑部的生长和发育以及维持成人正常脑功能是必需的 (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120 :S129_S138)。DHA 对于涉及信号传导过程、视紫红 质激活以及视杆细胞和视锥发育的感光细胞功能也有显著影响(Giusto，N.M.等(2000) Prog. Lipid Res. 39 :315-391)。此外，在如高血压、关节炎、动脉粥状硬化、压抑、血栓形成 和癌症等疾病的治疗中也发现DHA的一些积极效应(Horrocks，L. A.和Yeo，Y. K. (1999) Pharmacol. Res. 40 :211_215)。因此，通过膳食适当供应脂肪酸对于人维持健康是重要的。 对于婴儿、年纪小的儿童和年长的公民来说，从膳食摄取足够这些脂肪酸尤其重要，因为他 们在体内不能有效合成这些脂肪酸，必须通过食物补充(Spector，A. A. (1999) Lipids 34: S1-S3)。根据甲基端最后一个双键的位置，DHA是n-3系列的脂肪酸。它通过去饱和以及延 长的交替步骤合成。DHA的生物合成从18:3(9，12，15)开始，涉及A 6去饱和形成18:4(6，9，12，15)，然后延长到 20:4(8，11，14，17)，随后 A5 去饱和形成 20:5(5,8,11，14，17)。此 后，对于所述生物合成存在一些争议。传统观点是20:5(5，8，11，14，17)延长成为22:5(7， 10，13，16，19)，然后通过最后的 A 4 去饱和转化成为 22:6(4,7,10，13，16，19) (Horrobin， D.F. (1992) Prog. Lipid Res. 31 163-194)。然而，Sprecher 等最近提出 DHA 生物合成另一 个可能的途径，该途径不依赖于A 4去饱和酶，涉及两次连续的延长、一次A6去饱和以及 一次通过在过氧化物酶体中的限制性氧化缩短两个碳(SpreCher，H.等(1995) J. Lipid Res. 36 2471-2477 ；Sprecher, H.等(1999)Lipids 34 :S153_S156)。由于DHA对人类健康的有益作用，因此DHA的生产是重要的。目前DHA的主要来 源是鱼和藻类的油。鱼油是该脂肪酸的主要和传统来源，但是，到销售时，通常发生了氧化。 另外油的供应极不稳定，并且由于鱼量缩减，其来源处于危险中，而藻类来源由于产量低和 提取的高额费用而昂贵。EPA和AA都是A5必需脂肪酸。它们形成人和动物的食物和饲料组成部分的一个 独特种类。EPA属于n-3系列，在酰基链中有五个双键，EPA在海洋食物中发现，在来自北大 西洋的富含脂肪的鱼中很丰富。AA属于n-6系列，带有四个双键。AA在(0-3位置缺少一 个双键，这赋予它与EPA不同的特性。从AA生产的类二十烷酸有强烈的炎症和血小板凝集 特性，而从EPA生产的类二十烷酸有抗炎和抗血小板凝集特性。也可以从一些食物如肉、鱼 和蛋获得AA，但浓度较低。亚麻酸(GLA)是在哺乳动物中发现的另一种必需脂肪酸。GLA是超长链n-6 脂肪酸和各种活性分子的代谢中间体。在哺乳动物体内，长链多不饱和脂肪酸的形成受到 A6去饱和的速度限制。已经显示许多生理学和病理学状况如衰老、应激、糖尿病、湿疹和 一些感染抑制A6去饱和步骤。此外，GLA容易受到来自与某些疾病如癌症或炎症的氧化 和快速细胞分裂的催化。因此，在膳食中补充GLA能够降低这些疾病的风险。临床研究已 经显示在膳食中补充GLA有效治疗一些病理状况，如变应性湿疹、经前综合征、糖尿病、高 胆固醇血症以及炎症和心血管疾病。GLA的主要来源是植物油和微生物，植物如月见草(Oenotherabiermis)、琉璃苣 (Borago officinalis L.)、红酯栗(Ribes nigrum)，微生物如被孢霉属菌(Mortierella sp.)、毛霉菌属菌(Mucor sp.)和蓝细菌(Cyanobacteria)。然而，由于这些GLA来源的可得 性有巨大波动以及与提取过程有关的费用，因此这些GLA来源对于膳食补充不是理想的。专利技术简述脂肪酸的生物合成是植物和微生物的主要活动。然而，人合成必需脂肪酸如长链 多不饱和脂肪酸(LCPUFA)的能力有限。长久以来，人们一直认为生物技术是在植物和微生 物中操作生产脂肪酸的过程的有效方法。它节省成本、可再生并且副效应小。因此，已经 进行大量的艰苦的努力，意图通过操作植物、动物和微生物细胞生产各种化合物，包括特殊 脂肪酸和药用多肽。因此，生物技术是以安全成本_效益方式生产不饱和脂肪酸、尤其是 LCPUFA的诱人途径，以从这些脂肪酸获取最大治疗价值。本专利技术基于(至少部分基于)发现编码新型去饱和酶的核酸分子家族。尤其是 本专利技术的专利技术人已经鉴定涉及长链多不饱和脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：　　（ａ）包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７核苷酸序列或其互补序列的核酸分子；　　（ｂ）编码下述多肽的核酸分子，所述多肽包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：６或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８氨基酸序列或其互补序列；　　（ｃ）编码下述多肽的天然等位基因变异体的核酸分子，所述多肽包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８氨基酸序列或其互补序列。

【技术特征摘要】
US 2000-9-28 60/236303;US 2001-6-12 60/297562一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自(a)包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7核苷酸序列或其互补序列的核酸分子；(b)编码下述多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8氨基酸序列或其互补序列；(c)编码下述多肽的天然等位基因变异体的核酸分子，所述多肽包含SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8氨基酸序列或其互补序列。2.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自(a)一种包含下述核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列与SEQ ID N0:3、5、7的整 个核苷酸序列或其互补序列至少70%相同；(b)一种核酸分子，该核酸分子包含一种下述核酸的至少30个连续核苷酸的片段，所 述核酸包含SEQ ID NO :3、5、7的核苷酸序列或其互补序列；(c)一种编码下述多肽的核酸分子，所述多肽包含与SEQ IDN0:4、6或8的整个氨基酸 序列至少约50%相同的氨基酸序列；(d)一种编码下述多肽的片段的核酸分子，所述多肽包含SEQID N0:4、6或8的氨基酸 序列，其中所述片段包含SEQ ID NO :4、6或8的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸残基。3.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子在严格条件下与权利要求1或2核酸分 子的互补序列杂交。4.一种载体，所述载体包含权利要求1或2的核酸分子。5.权利要求4的载体，所述载体是一种表达载体。6.一种宿主细胞，所述宿主细胞是用权利要求5的表达载体转染的宿主细胞。7.权利要求6的宿主细胞，其中所述细胞选自植物细胞、微生物细胞和动物细胞。8.权利要求7的宿主细胞，其中所述植物细胞是从选自以下的油籽作物获得的细 胞亚麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、大豆(Glycine 和 So ja sp.)、向日葵 (Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、撤揽(Olea sp.)、红花 (Carthamus sp.)、可可(Theobroma cacoa)禾口花生(Arachis sp.)。9.权利要求8的宿主细胞，其中所述微生物细胞选自破囊壶菌属 (Thraustochytrium)、畸雌 腐霉(Pythium irregulare)、 Schizochytrium 禾口 Crythecodinium。10.一种生产多肽的方法，该方法包括培养权利要求6的宿主细胞以生产所述多肽。11.一种分离的多肽，所述多肽选自(a)一种多肽的片段，所述多肽包含SEQ ID NO :4、6或8的氨基酸序列，其中所述片段 包含SEQ ID NO :4、6或8的至少10个连续氨基酸；(b)一种多肽的天然等位基因变异体，所述多肽包含SEQ IDN0 :4、6或8的氨基酸序列， 其中所述多肽由一种下述核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与由SEQ ID N0:3、5 或7组成的核酸分子的互补序列杂交；(c)一种由下述核酸分子编码的多肽，所述核酸分子包含下述核苷酸序列，所述核苷酸 序列与包含SEQ ID NO :3、5或7的整个核苷酸序列的核酸至少70%相同；和(d)一种包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQID N0:4、6或8的整个氨基酸序列至少60%相同。12.权利要求11的分离的多肽，所述多肽包含SEQID NO :4、6或8的氨基酸序列。13.—种生产不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括用权利要求1或2的分离核酸分子转 染或转化细胞，然后在一定条件下培养所述细胞，从而生产所述不饱和脂肪酸。14.权利要求13的方法，其中所述细胞选自植物细胞、动物细胞和微生物细胞。15.权利要求14的方法，其中所述植物选自油籽作物。16.权利要求15的方法，其中所述油籽作物选自以下亚麻(Linumsp.)、油菜籽 (Brassica sp.)、大豆(Glycine 禾口 So ja sp.)、向日葵(Helianthus sp.)、棉花(Gossypium sp.)、玉米(Zea mays)、撤揽(Oleasp.)、红花(Carthamus sp.)、可可(Theobroma caco...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱晓，H洪，
申请(专利权)人：生物源食物及科学公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]