本发明专利技术适用于微生物技术领域，提供了一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括DNA提取液、PCR反应液。本发明专利技术蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒及检测方法能同时检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种。
技术介绍
蜡样芽胞杆菌是一种杆状、产生芽孢的革兰氏阳性细菌，由于蜡样芽胞杆菌自然界分布甚广，常存在于土壤、飞尘、腐草和空气中，极易在食品加工、运输、存储、销售过程中，通过苍蝇、蟑螂等昆虫和不卫生的用具和手污染。在临床上可导致脓肿、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎等报道，但最常见的是导致不同类型的食物中毒腹泻型和呕吐型。阪崎肠杆菌(又称阪崎氏肠杆菌)是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和茵血症，死亡率高达50%以上。金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表。金黄色葡萄球菌致病力强弱主要取决于其产生的侵袭性酶和毒素，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。国际上通用的金黄色葡萄球菌采用培养检测如下(I)样品处理无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制 成10-1稀释液。(2)增菌培养将10-1稀释液接入7. 5% NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。(3)分离培养将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37 0C培养24 48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2 3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。(4)染色观察从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0. 5 I y m。(5)血浆凝固酶试验吸取0. 5mL兔血浆与0. 5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36土1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。(6)耐热核酸酶试验将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36± I°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。阪崎肠杆菌采用培养法检测如下(I)前增菌和增菌取检样IOOg(mL)加入已预热至44°C装有900mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36°C ±1°C培养18h±2h。移取ImL转种于IOmL ST-Vm肉汤，440C ±0. 5°C培养 24h±2h。⑵分离轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物I环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36 °C ±1°〇培养2处±211。挑取I个 5个可疑菌落，划线接种于TSA平板。25°C ±1°C培养 48h±4h。 ⑶鉴定自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。(4)结果与报告综合菌落形态和生化特征，报告每IOOg(HiL)样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。根据上述通用方法，同时检测样品中蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌这三种细菌的周期长(至少48小时)、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂(生化试验试剂和血清)繁多等缺点已远远不能满足快速检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的要求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒，解决现有技术中同时检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌灵敏的低，周期长等技术问题，以及蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的检测方法。本专利技术是这样实现的，一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液,所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石腊,所述第一反应液中包括蜡样芽孢杆菌正向引物、蜡样芽孢杆菌反向引物、蜡样芽孢杆菌探针、阪崎肠杆菌第一引物、阪崎肠杆菌第二引物、阪崎肠杆菌探针、金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针，所述蜡样芽孢杆菌正向引物序列如SEQ ID NO :1所示，蜡样芽孢杆菌反向引物序列如SEQ ID NO :2所示，蜡样芽孢杆菌探针序列如SEQ ID NO :3所示，阪崎肠杆菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，阪崎肠杆菌第二引物序列如SEQ ID NO 5所示，阪崎肠杆菌探针序列如SEQ ID NO :6所示，金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ IDNO 7所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ ID NO 8所示，金黄色葡萄球菌探针序列如 SEQ ID NO :9。本专利技术进一步提供一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测方法，包括如下步骤提供蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的DNA样品；进行荧光定量PCR检测，该荧光定量PCR检测步骤中使用前述的蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒。本专利技术能同时检测蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌，不用对待测样品进行长时间的增菌培养，同时加入有检测引物和探针，与传统的培养法相比具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌的检测。附图说明图I是本专利技术实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒中阳性对照PCR扩增图；图2是本专利技术实施例蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒阴性对照PCR扩增图；图3是本专利技术实施例一蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试方法中阳性样本PCR扩增图； 图4是本专利技术实施例一蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试方法中阴性样本PCR扩增 图5是蜡杨芽孢杆菌培养法检测流程图。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。本专利技术实施例提供一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液中包括蜡样芽孢杆菌正向引物、蜡样芽孢杆菌反向引物、蜡样芽孢杆菌探针、阪崎肠杆菌第一引物、阪崎肠杆菌第二引物、阪崎肠杆菌探针、金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针，所述蜡样芽孢杆菌正向引物序列如SEQ IDNO :1所示，蜡样芽孢杆菌反向引物序列如SEQ ID NO :2所示，蜡样芽孢杆菌探针序列如SEQID NO :3所示，阪崎肠杆菌第一引物序列如SEQ ID NO :4所示，阪崎肠杆菌第二引物序列如SEQ I本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液中包括蜡样芽孢杆菌第一引物、蜡样芽孢杆菌第二引物、蜡样芽孢杆菌探针、阪崎肠杆菌正向引物、阪崎肠杆菌反向引物、阪崎肠杆菌探针、金黄色葡萄球菌第一引物、金黄色葡萄球菌第二引物、金黄色葡萄球菌探针，所述蜡样芽孢杆菌第一引物序列如SEQ？ID？NO：1所示，蜡样芽孢杆菌第二引物序列如SEQ？ID？NO：2所示，蜡样芽孢杆菌探针序列如SEQ？ID？NO：3所示，阪崎肠杆菌正向引物序列如SEQ？ID？NO：4所示，阪崎肠杆菌反向引物序列如SEQ？ID？NO：5所示，阪崎肠杆菌探针序列如SEQ？ID？NO：6所示，金黄色葡萄球菌第一引物序列如SEQ？ID？NO：7所示，金黄色葡萄球菌第二引物序列如SEQ？ID？NO：8所示，金黄色葡萄球菌探针序列如SEQ？ID？NO：9。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴成贡，卢柳燕，龚剑，田仁鹏，汪再兴，黄娟，
申请(专利权)人：深圳市生科源技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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