共表达布鲁氏菌重组腺病毒及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开一种布鲁氏菌重组腺病毒、该重组腺病毒的制备方法，以及这种重组腺病毒在布鲁氏菌基因工程疫苗中的用途。本发明专利技术的共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体中包括有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列为SEQ№1，并以复制缺陷型Ad5腺病毒为载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组病毒及这种重组病毒的制备及用途，特别是涉及ー种布鲁氏菌重组腺病毒、该重组腺病毒的制备方法，以及这种重组腺病毒在布鲁氏菌基因工程疫苗中的用途。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella spp.)引起的一种人畜共患传染病，又称为马耳他热或波状热，简称布病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病，我国也将其列为ニ类动物疫病，直接影响畜牧业发展，严重威胁着人类健康，造成巨大经济损失(蔡宝祥，2001)。布鲁氏菌病因其独特的致病机制及胞内寄生感染后难以根治的特点，除了大規模扑杀，应用疫苗预防一直是动物布鲁氏菌病防控最有效且经济的手段(Ko et al.，2003)。虽然布鲁氏菌疫苗种类较多，也为世界布病的免疫防控发挥了重要作 用，但至今还没有一种布鲁氏菌传统疫苗在国际上获得普遍或持久应用，原因是现有的各类型疫苗在保护效果、安全性和制作成本等方面均存在着不同程度相互矛盾而又难以克服的缺点。随着现代基因工程技术、分子生物学和免疫学的快速发展，新一代布鲁氏菌分子疫苗可以兼顾免疫保护性抗原的多价性、表达载体的高效性、疫苗佐剂的靶向性、接种途径的简便性、安全有效性等特点，能有效激发机体产生免疫应答和免疫保护效果(Ko et al.，2003)。L7/L12核蛋白(Ribosome protein)是布鲁氏菌重要的T细胞优势抗原,在核糖体亚单位中以四个拷贝的形式存在，能够诱导细胞免疫应答的产生，在各菌株中具有高度的保守性(Bachrach et al.，1994)。L7/L12蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞，并上调IFN-Y的表达，从而起到保护作用(Winter et al.，1996)。外膜蛋白BCSP31也是抗布鲁氏菌感染重要的抗原分子。Yu等(2007)制备了包含BCSP31的基因疫苗，免疫BALB/c小鼠肌肉或腹腔内产生了 CTL效应和特异性抗体应答，但在整体免疫应答和免疫保护效果上还存在着诸多问题。客服现有疫苗技术的不足，寻找ー种可以长期使用而不产生毒カ返强，培养生产更为容易的布鲁氏菌疫苗对保证食品和公共卫生安全，保护人民健康，维护社会稳定，促进养殖业可持续发展等具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种共表达布鲁氏菌重组腺病毒，以及这种病毒的制备方法和用途。本专利技术的共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体中包括有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列为SEQN2 1，并以复制缺陷型Ad5腺病毒为载体。本专利技术的含有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表达重组腺病毒制备方法是a.从流产布鲁氏菌2型CVCC 12株提取细菌总DNA，以此为模板，分别以SEQ2、SEQ3和SEQ4、SEQ5为引物进行聚合酶链式反应，得到L7/L12和BCSP31目的蛋白基因；b.将阳性 pMD-LL 和 pQCXIX Retroviral Vector 质粒，用 Not I 和 BamH I 内切酶分别进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒进行切胶纯化，再将回收后的L7/L12目的基因用T4DNA连接酶连入pQCXIX载体的MCS I位点中，同法用Mlu I和Xho I内切酶将BCSP31基因定向克隆于pQCXIX载体的MCS II位点；C.将b步骤得到的带有外源性目的基因的pQCXIX转化JM109感受态细胞，获得阳性质粒 pQC-LL/BP ；e.将pQC-LL/BP和pShuttIe-CMV质粒，用Not I和Xho I内切酶分别进行双酶切，纯化回收L7/L12-IRES-BCSP31目的片段和线性化的pShuttle_CMV载体片段，再将两种回收产物用T4DNA连接酶进行定向连接，然后转化E. coli JM109感受态细胞，在含kan抗性的琼脂平板上挑取单克隆，并于LB液体抗性培养基中增菌后，得到阳性质粒pSh-LL/BP ； f.将pSh-LL/BP阳性质粒，进行Pme I单酶切后，用こ醇沉淀法收获线性化的重组腺病毒穿梭载体pSh-LL/BP ；g.将pAdEasy-Ι空腺病毒骨架载体常规CaCl2法转化BJ5183感受态细胞，得到BJ5183-AD-1 细菌；h.挑选有氨苄抗性的BJ5183-AD-1单克隆菌落，接种于无抗生素LB培养基，37°C，220rpm摇床培养12 14h，制成宿主液；i.将经线性化的重组腺病毒穿梭载体pSh-LL/BP和含有骨架载体pAdEasy-Ι的BJ5183细菌感受态细胞转移到冰预电转移杯中进行电转化处理，得到含有SEQl序列的重组腺病毒阳性质粒pAd-LL/BP，再用阳性pAd-LL/BP转化DHlOB感受态细胞；j.纯化h步骤得到的DHlOB感受态细胞，并进行线性化处理，将线性化的重组腺病毒骨架质粒转染293AD细胞，得到含有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表达重组腺病毒 Ad-LL/BP。本专利技术的共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体可在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。本专利技术的共表达布鲁氏菌重组腺病毒可为动物布鲁氏菌提供一种更为安全的分子疫苗或免疫制剂，可刺激机体产生特异性抗体，有效诱导以细胞免疫为主的免疫应答反应。本专利技术的腺病毒活载体制备的疫苗不存在毒力返强的安全隐患，还具有外源基因容量大，宿主范围广，可获得较高滴度的抗原，并容易浓缩和纯化，疫苗免疫方便等优点。相关实验表明，本专利技术具有如下优点(I)采用人腺病毒血清5型载体为表达载体，可对目的蛋白进行有效表达，而且有效诱导以细胞免疫为主的免疫应答反应，具有良好的免疫原性；(2)本专利技术采用第三代腺病毒载体，仅保留了两端非编码基因倒置重复序列与包装信号，不存在毒力返强危险，这也在实践中得到了证实，如用该载体制备的其它腺病毒疫苗或表达载体已在人和动物上多有应用，实施例3结果也表明本专利技术所构建的共表达重组腺病毒对小鼠没有致病性，感染后不出现临床征状，没有毒性反应，安全性良好；(3)本专利技术实现了布鲁氏菌L7/L12和BCSP31双基因重组腺病毒共表达，并获得了较高的滴度，滴度可达109 68TCID5(l/mL。(4)腺病毒颗粒相对稳定，容易浓缩和纯化(具体见实施例2中PCR稳定性鉴定及重组腺病毒TCID5tl測定)。附图说明图I为重组腺病毒在293AD细胞上引起的细胞病变；A :转染后7天的CPE ；B :接度感染后48h的CPE ；C :正常对照细胞。图2为重组腺病毒Ad-LL/BP的PCR鉴定；M DL2000分子量标准；N 阴性对照；I，2，3和8 :分别为第5、10、15和20代腺病毒L7/L12基因PCR产物；4 7 :分别为第5、10、15和20代腺病毒BCSP31基因PCR产物。图3为间接免疫荧光法检测重组腺病毒L7/L12及BCSP31基因表达；A :重组腺病毒Ad-LL/BP感染的293AD细胞；B :空载体Ad-CMV感染的293AD细胞。图4为Western blot检测重组腺病毒L7/L12及BCSP31蛋白的表达；M :蛋白质分子量标准；N:空载体Ad-CMV感染的293AD细胞；1和2 :重组腺病毒Ad-LL/BP感染的293AD细胞。图5为ELISA检测免疫小鼠血清IgG特异性抗体。 图6为末次免疫后2周小鼠血清IgGl和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体，其特征在于共表达布鲁氏菌重组腺病毒活载体中包括有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因，其序列为SEQN2 1，并以复制缺陷型Ad5腺病毒为载体。2.权利要求I所述的含有布鲁氏菌L7/L12和BCSP31基因的共表达重组腺病毒制备方法，其特征在于a.从流产布鲁氏菌2型CVCC 12株提取细菌总DNA，以此为模板，分别以SEQ2、SEQ3和SEQ4、SEQ5为引物进行聚合酶链式反应，得到L7/L12和BCSP31目的蛋白基因； b.将阳性pMD-LL 和 pQCXIX Retroviral Vector 质粒,用 Not I 和 BamH I 内切酶分别进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒进行切胶纯化，再将回收后的L7/L12目的基因用T4 DNA连接酶连入pQCXIX载体的MCS I位点中，同法用Mlu I和Xho I内切酶将BCSP31基因定向克隆于pQCXIX载体的MCS II位点； c.将b步骤得到的带有外源性目的基因的pQCXIX转化JM109感受态细胞，获得阳性质粒 pQC-LL/BP ； e.将pQC-LL/BP和pShuttle-CMV质粒，用NotI和Xho I内切酶分别进行双酶切，纯化回收L7/L12-IRES-BCSP31目的片段和线性化的pShuttl...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔺国珍，邱昌庆，郑福英，景志忠，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：