一种氨基甲酸乙酯人工抗原的合成方法，经过如下步骤制成：一是β-丙氨酸和氯甲酸乙酯试剂的配置；二是半抗原的合成；三是半抗原的提纯；四是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液的配制；五是人工抗原的合成；六是人工抗原的透析和检测；七是不同载体蛋白用量的计算。本方法通过化学合成得到的半抗原受蛋白的屏蔽作用小，在免疫动物体内可产生高效价的多克隆抗体，在合成人工抗原的同时检测其分子量，计算出偶联比，合成的原料用量精确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人工抗原的合成方法，具体为。
技术介绍
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC),又名乌拉坦、尿烧,是食物和酒精饮品在发酵或贮存过程中天然产生的污染物。早在20世纪40年代氨基甲酸乙酯就被Nettleship证 实为致癌物质，2007年，国际癌症研究机构把氨基甲酸乙酯重新分类为第2A组。研究表明，氨基甲酸乙酯作为一种多位点致癌物，会导致啮齿动物产生肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病，并且还发现乙醇对氨基甲酸乙酯的致癌性有促进作用。目前氨基甲酸乙酯的测定方法主要以气相色谱分析为主，配以各种不同的检测，包括气相色谱-氢焰离子化检测器法(GC-FID)、气相色谱/热离子检测器法(GC-TSD)、二氯甲烷萃取与气相色谱-质谱联用仪法(GC-MS)等，如200910099554.0 “一种检测黄酒中氨基甲酸乙酯的方法”，201110339615. 3 “一种快速测定蒸馏酒中氨基甲酸乙酯含量的方法”，都采用了前处理过程和大型仪器测定，很难实现对氨基甲酸乙酯快速、经济的检测。在200710190350. 9 “酒类中氨基甲酸乙酯的高灵敏时间分辨荧光免疫分析方法”中，虽然进行了后续的免疫操作，但在人工抗原合成过程中未检出偶联比，原料用量依据经验，无理论支持。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种。解决该技术问题采用如下技术方案I.包括下列步骤一、半抗原的制取(I)试剂A的配制用4. 45重量份的P -丙氨酸，溶于100重量份质量比为4%的NaHCO3水溶液中，制得试剂A备用；(2)试剂B的配制用4. 14重量份的氯甲酸乙酯，溶于30重量份三氯甲烷纯溶液中，制得试剂B备用；(3)半抗原的合成将试剂A缓慢加入到试剂B中，用NaOH调整pH值使其稳定在9-11，冰浴下搅拌反应Ih ;然后升温至40°C，保温反应I. 5h，缓慢加HCl调pH值至2-3 ；(4)萃取用乙酸乙酯萃取经步骤一(3)制得的反应液，共萃取三次，每次50重量份乙酸乙酯，合并有机相；(5)去除溶剂用无水Na2SO4去除有机相中的水，过滤，滤液蒸馏去除乙酸乙酯；(6)冷冻结晶加入10重量份乙酸乙酯进行重结晶，置于_20°C中冷冻结晶，过滤收集，得半抗原晶体3. I重量份。二、人工抗原的制备(I)透析袋的预处理透析袋先在去离子水中浸泡lmin，然后在电炉上用质量比2%的碳酸氢钠和0. 4 %的EDTA混合液煮沸lOmin，然后去离子水清洗干净，再用0. 4%的EDTA煮沸lOmin，缓慢冷却后用去离子水清洗至清晰，最后用去离子水浸泡，4°C保存待用；(2)试剂C的配制将I-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺加入到pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，配制成质量比为0. 3%的试剂C ；(3)人工抗原的合成取0. 2重量份半抗原加入到5重量份试剂C中，室温反应lh，加入5重量份载体蛋白，慢速振摇中偶联反应4h ；(4)透析将经步骤二(3)制得的偶联反应物置于经步骤二(I)预处理的透析袋中，用pH值7. 4的磷酸盐缓冲液透析三天，将内容物洁净保存，即得人工抗原。2.步骤二(3)中所述的载体蛋白，可以选择牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋 白、钥孔血蓝蛋白中任一种。本专利技术的有益效果是合成的半抗原受蛋白的屏蔽作用小，使其在免疫动物体内产生高效价的多克隆抗体，在合成人工抗原的同时检测出分子量，计算出偶联比，合成的原料用量精确。附图说明图I半抗原的液体红外光谱2 BSA的基质辅助激光解析飞行时间质谱3人工抗原的基质辅助激光解析飞行时间质谱图具体实施例方式本专利技术下面结合实施例并参照附图作进一步详述下面介绍具体实施例。备料牛血清蛋白、I- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为Sigma产品；氨基甲酸乙酯为梯希爱化成工业发展有限公司产品；实验用其他试剂均为分析纯。选用的仪器IR Prestige-21傅立叶变换红外光谱仪为日本岛津公司产品；AVANCE AV-300核磁共振波谱仪为瑞士 BRUKER公司产品；Voyager-DE STR基质辅助激光解析飞行时间质谱为美国应用生物系统公司产品I.半抗原的制备(I)称取4.45g P -丙氨酸，溶于IOOmL质量体积比4%的NaHCOyK溶液中，作为试剂A，4. 14g氯甲酸乙酯溶于30mL三氯甲烷中，作为试剂B。将A逐滴加入B中，冰浴下搅拌反应lh，每隔5min检测pH值，并用2%的NaOH水溶液调整反应体系pH在9_11中。对体系加热，升温至40°C，继续反应I. 5h后停止加热。缓慢滴加浓盐酸，调整至pH 2-3。用乙酸乙酯萃取反应液，每次50mL共三次，合并有机相液，无水Na2SO4干燥，过滤，蒸馏除去乙酸乙酯，加入少量乙酸乙酯，放置于-20°C冰柜结晶，得晶体3. lg，即为实验所需半抗原，产率70%。用红外光谱、核磁共振波谱检测其结构式。(2)红外光谱检测显示，在2500-34000^1处存在的宽吸收带归属为产物中羧基的轻基与羰基、仲胺的缔合特征带；在1750CHT1处有一强吸收带,系羰基的特征吸收带,与氯甲酸乙酯的红外相比，红移了 50CHT1，这是由于氯甲酸乙酯中羰基旁的-Cl电负性强，反应后被取代，使得羰基吸收带红移。该分析结果说明合成反应成功。半抗原用氘代二氯甲烷溶解，核磁共振波谱检测氢谱，得到结果显示，除了有目标产物外，还有少量杂质，经质谱检测杂质为￠-丙氨酸与目标产物再次反应，形成多聚物，但其含量不影响后续实验。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种氨基甲酸乙酯人工抗原的合成方法，其特征在于包括下列步骤 一、半抗原的制取 (1)试剂A的配制用4.45重量份的￠-丙氨酸，溶于100重量份质量比为4%的NaHCO3水溶液中，制得试剂A备用； (2)试剂B的配制用4.14重量份的氯甲酸乙酯，溶于30重量份三氯甲烷纯溶液中，制得试剂B备用； (3)半抗原的合成将试剂A缓慢加入到试剂B中，用NaOH调整pH值使其稳定在9-11，冰浴下搅拌反应lh，然后升温至40°C，保温反应I. 5h，缓慢加HCl调pH值至2-3 ； (4)萃取用乙酸乙酯萃取经步骤一(3)制得的反应液，共萃取三次，每次50重量份乙酸乙酯，合并有机相； (5)去除溶剂用无水Na2SO4去除有机相中的水，过滤，滤液蒸馏去除乙酸乙酯； (6)冷冻结晶加入10重量份乙酸乙酯进行重结晶，置于-20°C中冷冻结晶，过滤收集，得半抗原晶体3. I重量份。二、人工抗原的制备 (1)透析袋的预处...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭明，周伟，敬娇，谢广发，周建钟，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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