化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段及其表达、应用制造技术

本发明专利技术化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、抗体和试剂盒领域。本发明专利技术是通过计算机分析，筛选出金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的强抗原表位，第40个氨基酸至第194个氨基酸，共155个氨基酸，选择原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的强抗原表位片段。表达的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的强抗原表位片段，可用于金黄色葡萄球菌抗体的检测及用于免疫制备抗金黄色葡萄球菌的单抗和多抗等。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、抗体和试剂盒领域。本专利技术是通过计算机分析，筛选出金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的强抗原表位，第40个氨基酸至第194个氨基酸，共155个氨基酸，选择原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的强抗原表位片段。表达的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的强抗原表位片段，可用于金黄色葡萄球菌抗体的检测及用于免疫制备抗金黄色葡萄球菌的单抗和多抗等。【专利说明】化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白CIfA基因片段及其表达、应用
本专利技术涉及的是化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA基因片段，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的表面蛋白ClfA。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的ClfA片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及金黄色葡萄球菌快速检测等，本专利技术涉及基因工程技术和诊断试剂领域。
技术介绍
金黄色葡萄球菌是一种重要的人兽共患病原菌，是一种世界公认的导致人类和动物化脓性疾病的致病因子，也是引起食物中毒的重要因子。它能导致皮肤和软组织感染以及危及生命的菌血症转移性并发症，如肺炎、心内膜炎、化脓性关节炎和骨髓炎。金黄色葡萄球菌在医院内是一个可以检测的病原体，它会导致免疫功能低下的宿主、手术病人和留置医疗设备感染。传统鉴定和分离金黄色葡萄球菌的方法步骤较多，并且具有一定的局限性。大多数免疫学技术例如荧光标 记抗体实验、酶联免疫试验(ELISA)、放射性免疫试验等都得到广泛应用，但它们所需成本较高、耗时且需对样品进行复杂的处理，限制其在生活中的广泛应用。建立一种简单、快速、适合现场应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有重要的意义。金黄色葡萄球菌产生的细胞外结合基质蛋白(ECMBP)，包括FnBP、ClfA和Ebp等，它们均为细菌表面的蛋白成分，具有相似的结构。其中，ClfA在细菌生长的各个阶段都出现，且几乎存在于所有金黄色葡萄球菌表面，是金黄色葡萄球菌表面重要的粘附素，可介导金黄色葡萄球菌粘附到宿主基质蛋白上，这是金黄色葡萄球菌感染的重要一步。金黄色葡萄球菌在生长期内都有产生ClfA，静止期内大量表达。不同菌株中ClfA的功能结构域高度保守，促使ClfA成为金黄色葡萄球菌抗体研究中的热门粘附因子。有报告指出，用免疫荧光技术分析野生型NewMan株和clfa::Tn917 NewMan突变株抗ClfA A区是裸露在细菌细胞表面的。通过用试纸条检测金黄色葡萄球菌菌液的阳性结果可以说明CIfA蛋白很可能是暴露与金黄色葡萄球菌加膜外蛋白或者说不被荚膜完全遮蔽。
技术实现思路
本专利技术是化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的ClfA的部分片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的部分片段，第40个氨基酸一第194个氨基酸，共155个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗，亦可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备为金黄色葡萄球菌检测方法的建立奠定了基础。通过计算机软件分析，筛选出金黄色葡萄球菌的特异性表面蛋白ClfA抗原表位富集区，选择原核生物偏爱的密码子优化基因序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达。表达的蛋白具有较好的抗原性和特异性，可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，组装胶体金试剂条，为金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立奠定基础。化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的155个氨基酸的基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实现的: 1.金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成: 利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的全氨基酸序列，发现金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的N端(第40氨基酸一第194氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了ifei I酶切位点(下画线部分)，在3’端增加了终止密码子(TGA)和ZA0 I酶切位点(下画线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒PGEX4T-2饱BernH I和ZAo I酶切位点内。筛选的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA内的抗原表位氨基酸序列(第40个aa —第194 个 aa):【权利要求】1.一种化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，即第40个氨基酸至第194个氨基酸，共155个氨基酸，在该基因片段的5’端增加了 I酶切位点，在3’端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点，化学合成的基因序列全长480bp，序列如下:GGATCC AGC GAA AAT AGC GTG ACC CAA AGC GAC TCC GCC TCA AAC GAA AGC AAATCC AAT GAC TCA AGT TCT GTC TCA GCA GCA CCG MG ACG GAT GAC ACC MT GTC TCG GATACG AM ACC AGC TCT AAC ACG MC MT GGC GAA ACC AGC GTG GCG CAG MT CCG GCC CAGCM GAA ACC ACG CAA AGT TCC TCA ACC AAC GCG ACC ACG GM GM ACG CCG GTT ACC GGTGAA GCC ACC ACG ACC ACG ACC MC CAG GCA AAT ACG CCG GCT ACG ACC CM TCG AGC AACACC MT GCA GAA GAA CTG GTC MT CAG ACC TCT AAC GM ACG ACC TTT AAC GAC ACG AATACC GTG TCT AGT GTT MT TCC CCG CAG AAC TCA ACC AAT GCC GM AAC GTG TCA ACG ACCCAG GAT ACC AGC ACG GAA GCG ACC CCG AGC AAC AAC GM TCA GCA CCG CAG TCA ACC TMCTCGAG 。2.权利要求1所述的化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下: 金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段重组质粒的构建: 用BamH UWXho I双酶切质粒pGEX4T_2和化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，电泳回收后，用T4 DNA连接酶连接，使金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段插入到载体PGEX4T-2内的BeuM I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长381个氨基酸，该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白ClfA基因片段，即第40个氨基酸至第194个氨基酸，共155个氨基酸，在该基因片段的5'端增加了BamH I酶切位点，在3'端增加了终止密码子TAA和Xho I酶切位点，化学合成的基因序列全长480bp，序列如下：GGATCC  AGC GAA AAT AGC GTG ACC CAA AGC GAC TCC GCC TCA AAC GAA AGC AAA TCC AAT GAC TCA AGT TCT GTC TCA GCA GCA CCG AAG ACG GAT GAC ACC AAT GTC TCG GAT ACG AAA ACC AGC TCT AAC ACG AAC AAT GGC GAA ACC AGC GTG GCG CAG AAT CCG GCC CAG CAA GAA ACC ACG CAA AGT TCC TCA ACC AAC GCG ACC ACG GAA GAA ACG CCG GTT ACC GGT GAA GCC ACC ACG ACC ACG ACC AAC CAG GCA AAT ACG CCG GCT ACG ACC CAA TCG AGC AAC ACC AAT GCA GAA GAA CTG GTC AAT CAG ACC TCT AAC GAA ACG ACC TTT AAC GAC ACG AAT ACC GTG TCT AGT GTT AAT TCC CCG CAG AAC TCA ACC AAT GCC GAA AAC GTG TCA ACG ACC CAG GAT ACC AGC ACG GAA GCG ACC CCG AGC AAC AAC GAA TCA GCA CCG CAG TCA ACC TAA CTCGAG 。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李越希，许桂丽，蔡冉，潘英，李素芹，李丙军，陈乐如，周洁，张素芬，马颖，袁敬宇，徐悦玥，尚彦红，
申请(专利权)人：李越希，
类型：发明
国别省市：江苏;32