本发明专利技术涉及从脐带中分离和扩增间充质干细胞的方法。其包括如下步骤：对脐带组织进行消毒和清洗；将组织剪成块状，再平铺于另一细胞培养平皿中，使组织块风干直至组织贴在平皿上；使脐带组织培养在间充质干细胞专用培养基中进行培养，培养至第11-13天并进行补/换液后时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天进行一次全换液；当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70%左右时，使用消化酶使贴壁细胞脱离平皿底部；离心去上清液，加入间充质干细胞专用培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得脐带间充质干细胞。本发明专利技术方法可有效用于分离和扩增间充质干细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及从脐带新鲜组织中分离和扩增干细胞的方法，特别涉及从脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法。
技术介绍
研究发现骨髓中蕴含丰富的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),由于这类细胞具有多向分化潜能、免疫调控和自我复制等特点，所以渐渐受到人们的关注。间充质干细胞能诱导分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰 退；移植给异体可能引起免疫反应；提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓间充质干细胞的临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。近期的研究显示，脐带组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。因此，本领域需要有从脐带中分离和扩增间充质干细胞的简单、有效的方法，以满足临床需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有获取脐带间充质干细胞方法的缺陷，提供一种实用简单的从体外脐带中分离和扩增间充质干细胞的方法。本专利技术发现使用一种组织贴壁法可以有效地从脐带组织分离原代间充质干细并进行培养。本专利技术基于此发现而得以完成。因此，本专利技术第一方面提供了从脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤(I)消毒和清洗用酒精将脐带组织表面消毒；将脐带从中间剪开，平铺在平皿上；利用PBS清洗组织，以减少组织上的红细胞；(2)脐带组织贴壁处理将组织剪成块状，再平铺于另一细胞培养平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5-20块(例如10-15块)；使组织块风干2-50分钟(例如5-25分钟，例如10-15分钟)直至组织贴在平皿上；(3)脐带组织培养沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞专用培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5%的37°C培养箱进行培养，培养至第3-7天(例如第4-6天，例如第5天)时将平皿从培养箱取出，补加适量(使组织淹没即可)间充质干细胞专用培养基；在第9-11天(例如第10天)时将平皿中的培养基移出，加入适量(使组织淹没即可)新鲜的间充质干细胞专用培养基，继续培养；在第11-13天(例如第12天)时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天(例如每2天)进行一次全换液；(4)细胞传代当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70%左右时，使用消化酶(例如TrypLE Express, invitrogen产品)使贴壁细胞脱离平皿底部；离心,去除上清液,加入间充质干细胞专用培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的下列一个或多个步骤 (5)针对步骤(4)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(6)将步骤(4)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。根据本专利技术第一方面的方法，其中所述脐带是脐带的新鲜组织。根据本专利技术第一方面的方法，其中所述脐带组织处理在生物安全柜内进行。根据本专利技术第一方面的方法，其中所述培养平皿是直径5-20cm的培养平皿，优选是直径约IOcm的培养平皿。根据本专利技术第一方面的方法，其中所述PBS是磷酸的钠盐和/或钾盐配制的，其pH为5. 0-8. 0 (优选pH为5. 5-7. 6，优选pH为6. 0-7. 0)。在一个实施方案中，所述PBS中磷酸根的浓度为0. 01-0. 5M，优选0. 02-0. 1M。在本专利技术下文试验中，所用PBS是磷酸钠盐，其中磷酸根的浓度为0. 025M，pH为6. 5。需要说明的是，本专利技术人发现，在上述范围内的PBS浓度和PH值对于本专利技术方法的效果影响不大。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(2)中，剪碎的组织是大小约0. 2-2. 5立方厘米,例如大小约0. 5-1. 5立方厘米，例如大小约I立方厘米的立方形块状。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(2)中，剪碎的组织大小在0. 5-1. 5立方厘米，优选0. 5-1. 0立方厘米，特别是大小约I立方厘米时是非常优选的。尽管预期组织碎块小有利于本专利技术方法的实现，然而本专利技术人在试验中发现在0. 2立方厘米、0. 5立方厘米、I立方厘米三种状态下，它们对增加脐带组织贴壁效果、减短贴壁细胞从组织爬出的时间等效果方面基本一致，而体积大于I. 5立方厘米以后对增加脐带组织贴壁效果、减短贴壁细胞从组织爬出的时间等效果有显著的不利影响。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(2)中，组织块风干的时间为2-50分钟，例如5-25分钟，例如10-15分钟。本专利技术人发现在10-15分钟的风干时间内，对增加脐带组织贴壁、减短贴壁细胞从组织爬出的时间等效果方面是最佳的，比风干时间短于5分钟或者风干时间长于25分钟时均有显著的差异。根据本专利技术第一方面的方法，其中所述间充质干细胞专用培养基中包含FBS、L-Glutamine> Gentamicin和DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有10-20%的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有约15%的FBS。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有0. 5-2%的L-Glutamine。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有约1%的L-Glutamine (L-谷氨酰胺)。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有0.02-0. 1%的Gentamicin(庆大霉素)。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有约0. 05%的Gentamicin。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有80-90%的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有约84%的DMEM-F12。在一个实施方案中，所述间充质干细胞专用培养基中含有约15重量份的FBSj^ I重量份的L-Glutamine、约0. 05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12。本专利技术人发现，含有约15重量份的FBSj^J I重量份的L-Glutamine、约0. 05重量份的Gentamicin和约84重量份的DMEM-F12的间充质干细胞培养基是特别优选的，比之于使该培养基的任一成分含量变化10%以上的配方在增加脐带组织贴壁、减短贴壁细胞从组织爬出的时间等效果方面具有显著优势。根据本专利技术第一方面的方法，其中步骤(3)中，使脐带组织块在培养基中培养共 11-13天，其中补充并更换一次培养基，此培养时间和条件是优选的。根据本专利技术第一方面的方法，在步骤(本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.从脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤 (1)消毒和清洗用酒精将脐带组织表面消毒；将脐带从中间剪开，平铺在平皿上；利用PBS清洗组织，以减少组织上的红细胞； (2)脐带组织贴壁处理将组织剪成块状，再平铺于另一细胞培养平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5-20块(例如10-15块);使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上； (3)脐带组织培养沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞专用培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5%的37°C培养箱进行培养，培养至第3-7天(例如第4-6天，例如第5天)时将平皿从培养箱取出，补加适量(使组织淹没即可)间充质干细胞专用培养基；在第9-11天(例如第10天)时将平皿中的培养基移出，加入适量(使组织淹没即可)新鲜的间充质干细胞专用培养基，继续培养；在第11-13天(例如第12天)时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天(例如每2天)进行一次全换液； (4)细胞传代当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70%左右时，使用消化酶(例如TrypLE Express, invitrogen产品)使贴壁细胞脱离平皿底部；离心,去除上清液,加入间充质干细胞专用培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代； 以及任选的下列一个或多个步骤 (5)针对步骤(4)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型； (6)将步骤(4)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。2.根据权利要求I的方法，其中所述脐带是脐带的新鲜组织。3.根据权利要求I的方法，其中步骤(2)中，剪碎的组织是大小约O.2-2. 5立方厘米。4.根据权利要求I的方法，其中步骤(2)中，组织块风干的时间为2-50分钟。5.根据权利要求I的方法，其中所述间充质干细胞专用培养基中包含FBS、L-Glutamine、Gentamicin 和 DMEM-Fl2。6.根据权利要求I的方法，其中 所述间充质干细胞专用培养基中含有10-20%的FBS ； 所述间充质干细胞专用培养基中含有O. 5-2%的L-Glutamine ； 所述间充质干细胞专用培养基中含有O. 02-0. ...
【专利技术属性】
技术研发人员：周丹，林卓衡，朱业峰，陈俊峯，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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