本发明专利技术涉及一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1?mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测融合基因E2A-PBX1的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明专利技术的试剂盒实现对外周血或骨髓中融合基因E2A-PBX1?mRNA进行定量检测，检测急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测融合基因E2A-PBX1的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本专利技术的试剂盒实现对外周血或骨髓中融合基因E2A-PBX1 mRNA进行定量检测，检测急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。
技术介绍
E2A-PBX1基因融合是由t (I ；19) (q23 ；pl3. 3)易位而形成的，产生的融合蛋白含有结合到PBXl同源结构域蛋白的DNA结合域上的E2A氨基端转录活化域，是急性淋巴细胞白血病(ALL)中常见的染色体畸变及基因异常，大约5%的儿童ALL和3. 3%的成人ALL携带这种异常染色体。携带有该易位的病人，其临床症状都比较凶险。早期的研究认为，t(l ；19)易位与治疗早期的复发相关，更为强烈的化疗能够抵消这种效应。最近的研究证明，治疗方案的改进已使携带t (I ；19)易位的儿童ALL预后极大改善，5年无白血病活存率已达89. 5%。目前常用的实验室检测方法主要包括染色体核型分析、FISH、PCR检测等。实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时焚光 PCR 的一种(Yuqi Z，Min Y，Johann WM，et al. 2002. Quantification ofHuman Immunodeficiency Virus Type IProviral DNA by Using TaqMan Technology. JCli Microbiol. 40(2) :675-678 ；Drosten C，Seifried E，Roth WK, et al. 2001, TaqMan5_-nuclease human immunodeficiency virus type I PCR assay with phage-packagedcompetitive internal control for high-throughput blood donor screening.JClin Microbiol,39 :4302-4308 ；Schuurman R，Descamps D，Weverling GJ, et al. 1996，Multicenter comparison of three commercial methods for quantification of humanimmunodeficiency virus type I RNA in plasma. J Clin Microbiol，34 :3016-3022 ;Christopherson C，Kidane Y,Conway B et al. 2000. PCR-based assay to quantify humanimmunodeficiency virus type I DNA in peripheral blood mononuclear cells. J ClinMicrobiol, 38 :630-634.)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。本试剂盒采用TaqMan荧光探针技术，选取融合基因E2A-PBX1及内参基因TBP为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，其中荧光探针5’端标记荧光发射基团FAM，3’端标记非荧光淬灭基团BHQ1，利用荧光PCR检测仪可在FAM通道检测荧光信号。由于内参TBP基因在细胞中的表达相对恒定，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正，用于整个核酸提取和反应体系的质量控制。通过简单易操作的核酸提取系统，结合实时荧光PCR检测系统运行一步法RT-PCR扩增程序，本试剂盒实现了检测的高效率、高灵敏和高特异。
技术实现思路
本专利技术涉及一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1的mRNA试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术快速、定量检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本专利技术的试剂盒实现对外周血或骨髓样本中融合基因E2A-PBX1 mRNA进行定量检测，检测急性淋巴细胞白血病(ALL)等血液系统肿瘤中融合基因E2A-PBX1的mRNA表达水平，以有利于评价患者化疗效果、预后及对微小残留病变复发的监测。其基本原理是利用荧光PCR技术，以融合基因E2A-PBX1及内参基因TBP为靶区域，分别设计特异性引物及荧光探针，在样本核酸纯化之后，通过含有逆转录酶(c-MMLV酶)、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂(RNasin)的一步法RT-PCR对E2A-PBX1基因的mRNA进行快速定量检测。为了实现本专利技术，我们采用了以下技术方案I)使用适当的核酸分析软件分别对已知的融合基因E2A-PBX1基因的核苷酸序列 进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的弓I物和探针均具有互补于E2A-PBX1基因的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了融合基因E2A-PBX1检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。同时设置了内参TBP基因作为相对定量标准，用于整个反应体系的质量控制，在本试剂盒中可作为内参对起始细胞量进行校正。2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物和探针，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ1。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20% )电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。3)适宜于一步法RT-PCR扩增的反应体系。反应体系包括逆转录酶、热启动Taq酶、2’_脱氧核苷三磷酸、RNA酶抑制剂(RNasin)、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李明，丁渭，陈华云，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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