便捷的乳制品病原体检测方法技术

本发明专利技术公开了一种便捷的乳制品病原体检测方法，包括以下步骤：1)设计大肠菌群、乳酸菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌的对应引物组各一套；2)待测液态乳制品进行前处理，作为DNA模板；3)核酸的恒温扩增：包括设置扩增反应体系、设置阴性对照、设置阳性对照；对上述扩增反应体系、阴性对照和阳性对照分别进行以下操作：先于60～65℃反应30～60分钟；然后使酶失活；4)结果的判读：将步骤3)所得的扩增反应体系、阴性对照和阳性对照各自所得反应液在可见光下直接用肉眼观察，或者在紫外灯照射的状态下用肉眼观察；从而判定待测液态乳制品的检测结果为阴性还是阳性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物检测技术，尤其是涉及乳与乳制品中病原微生物的现场定性检测技术，具体为一种乳制品病原体检测方法。
技术介绍
民以食为天，食以安为先。充足、营养和安全的食品是人类生存的基本需要。尽管科技进步显著降低了疾病对人类的危害，但食源性疾病仍是人类健康和生命的主要威胁之一。近年来疯牛病、禽流感、李斯特杆菌、猪链球菌等重大食品危害事件的频频爆发，也促使全球对食品安全的问题越来越重视。在美国，由于食品病原问题每年导致7，600万人生病，32万人住院，5，000人由于食品卫生而死亡，并为此每年支出65亿美元。而国内，我国发生的几起重大食物中毒事件都与微生物致病污染有关。如河南郑州市某高校发生鸡肠球菌污染食品引起367人集体食物中毒；山东省夏津县一起鼠伤寒沙门菌污染食物引起153人食物中毒事件；2005年四川的猪链球菌事件更是造成38人死亡，近200人中毒。诸多案例表明食源性病原菌常造成群发性的伤害，给人们的身体健康及生命财产造成相当的危害。2008年的‘奶粉事件’，乳制品中的三聚氰胺超标，更是将食品安全检测推向了高潮，由此引发了食品检测的革命风暴。中国食品业在经历了 2008年的牛奶之觞后，度过了较为平静的一年，但年终岁尾的“问题奶粉”又死灰复燃，可口可乐“雪碧含汞”，“主食转基因”安全问题引起全民激辩，春节期间，海南毒豇豆席卷全国……种种食品安全问题，使得人人自危。食品安全问题再次敲响了警钟！ 2010年2月9日，食品安全委员会成立，三位副总理携15部长共保食品安全。中共中央政治局常委、国务院总理温家宝27日下午3时接受中国政府网、新华网联合专访，与广大网友在线交流。在回答网友提出的“毒奶粉”等假冒伪劣产品时，温家宝说，对于整个社会来讲，道德问题十分重要，“我以为诚信和道德是现代社会应该解决的紧迫问题"，然而光有道德约束远远不够，我们不仅要制订详细的法律来约束不法商家的违法行为，更要有快捷、经济的检测方法，用于随时随地检测各种问题食品。目前用于检测乳制品中的病原体检测的国家标准有平板法、免疫法、real timePCR法，然而随着人们生活水平的提高，对乳制品的检测要求也不断的提高。传统的一些检测方法，虽然一直作为国家标准，但其缺陷也日益显现。首先，平板法需要很长时间，一般为六七天，而一些急于出售的乳制品，无法等待如此长的时间，待检测完毕，拿到检测报告后，该批次的乳制品就会由于旋转时间过长而过保质期；对一些表型特征变异的菌株，用传统的形态学经验很难辨别，受主观的经验影响较大。其次，目前一些养殖场为了逃避病原体检测，往往会给奶牛喂养一些含抗生素的饲料，导致在原奶中有较高的抗生素含量，从而平板法就会由于有抗生素的干扰，从而不能顺利检测到病原体的存在。再次，一个平板只能检测一个样本的一种病原体，一旦待测样本数很多，平板法则根本没办法满足，只能进行抽检，这样就会导致漏检率大大升高。 免疫法依赖抗原抗体的特异性反应来检测目的样本中的病原体，因此，实验的灵敏度很大程度上依赖于抗体的好坏一方面，制作抗体是一个耗时耗力的工作，而且即使抗体制作的再好，也会由于抗原表面决定簇类似的原因，使结果出现交叉反应；另一方面，有些病原变异极快，如病毒，或者一些菌属，存在很多的亚型，并且经常变异，从而使抗体失效，不能检测新的抗原。有些乳制品中加了一些色素，因此，由于免疫法是利用酶标仪的光吸收来判定结果的，因此，本底色过高，就很容易造成假阳性结果。Real time PCR是国家标准上唯一的一个基于核酸扩增的方法，不会受本底色和 抗生素的干扰，结果也较为可靠，然而最大的缺点就是通量较低，一个反应只能检测一种病原，一旦要检测多个病原，就需要多台PCR来完成，一旦有大量样本，就不能及时完成所有检测工作。同时该方法还需要昂贵的定量PCR仪，只能限定于实验室检测，不能走入寻常百姓家。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种，采用该方法无需复杂的仪器，并且用肉眼即可辨识检测结果，从而准确判断是否被病原体污染。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种，包括以下步骤I)、设计引物设计大肠菌群、乳酸菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌的对应引物组各一套；每套引物组中含有4条引物；2)、待测液态乳制品的前处理，依次进行以下步骤①、将待测液态乳制品于3 5°C下1000-2000rpm离心15 25min，弃上层悬浮物；②、在上述步骤的所得物中加入PBS，轻轻震荡从而使沉淀重新悬浮，于3 5°C下1000 2000rpm离心15 25min,弃上层悬浮物；所述PBS与步骤I)中的待测液态乳制品的体积比为8 12 50 ；③、重复步骤②2次(目的是为了除去乳脂和乳蛋白)；4000 6000g离心8 12min,弃上清；得沉淀；④、按照TEN IN的NaOH溶液为22 2. 8 3. 2的体积比，在步骤③所得的沉淀中加入TEN和IN的NaOH溶液，直至沉淀完全悬浮；⑤、先将步骤④的所得物于90 100°C加热7 9min，然后冷却至彡室温(放入冰盒中冷却至不高于室温)；⑥、将部分的步骤⑤所得物进行DNA浓度检测，其余的步骤⑤所得物于_20°C保存备用，作为DNA模板；3)、核酸的恒温扩增利用步骤I)所得的每套引物组分别进行以下操作①、步骤I)所得的每套引物组中的引物用DEPC处理水进行溶解稀释②、设置扩增反应体系2X 反应液(RM) *12. 5 μ I,Bst DNA 聚合酶 I μ I,4种引物各I μ 1，DNA 模板 2 μ I，荧光染料I μ I，DEPC处理水4. 5 μ I ;总反应体系为25 μ I ;③、设置阴性对照以同体积量的DEPC处理水代替步骤②扩增反应体系中的DNA模板，作为阴性对昭.④、设置阳性对照以同体积量的所述引物组所对应菌的标准DNA代替步骤②扩增反应体系中的DNA模板，作为阳性对照；⑤、上述扩增反应体系、阴性对照和阳性对照分别进行以下操作先于60 65°C反应30 60分钟；然后使酶失活；4)、结果的判读步骤3)所得的扩增反应体系、阴性对照和阳性对照各自所得反应液分别按照以下任一方式进行操作方式一、①、将步骤3)所得的扩增反应体系、阴性对照和阳性对照各自所得反应液在可见光下直接用肉眼观察，比较扩增反应体系反应液、阴性对照反应液和阳性对照反应液的混浊程度；当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液为白色混浊时，进入步骤②，否则进入步骤③；②、进行样品的判定当扩增反应体系反应液为澄清透明时，则待测液态乳制品的检测结果为阴性；SP，待测液态乳制品中不含有所述引物组所对应的菌；当扩增反应体系反应液为白色混浊时，则待测液态乳制品的检测结果为阳性；SP，待测液态乳制品中含有所述引物组所对应的菌；③、检测失败，需要重新进行检测；方式二、①、将步骤3)所得的扩增反应体系、阴性对照和阳性对照各自所得反应液在紫外灯照射的状态下用肉眼观察，比较扩增反应体系反应液、阴性对照反应液和阳性对照反应液的混浊程度；当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液出现强烈的蓝色荧光时，进入步骤②，否则进入步骤③；②、进行样品的判定、当扩增反应体系反应液为澄清透明时，则待测液态乳制品的检测结果为阴性；SP，待测液态乳制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：洪旭涛，邵晖，余文菁，程小璇，宓娅娜，
申请(专利权)人：杭州锐创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：