本发明专利技术公开了一种快速、双效的基于PCR的方法，该方法采用单个实时PCR反应来鉴别如粪便或环境(土壤、水)分离物的提取样本中两种或更多种病原体(包括贾第虫属和/或隐孢子虫属)。该方法对兽医临床和环境测试应用是特别有用的。与基于ELISA或JFA的常规检测方法相比，本方法更加灵敏。本发明专利技术还公开了在基于PCR的核酸检测方法中使用的内对照(IC)。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术公开的内容涉及一种PCR方法，该方法使得可以在单个测定中检测病原体，特别是贾第虫属(Giardia)和隐孢子虫属(Cryptosporidium)，的任何组合。
技术介绍
贾第虫属是原生动物寄生虫，是腹泻性痢疾遍及全世界的主要原因。贾第虫属的最普通物种是兰伯氏贾第虫(G. lamblia)，它是南美最常见的病原寄生物(Meyer和 Jarrol (1980) Am. J. Epidemiol. 3 :1-12)。贾第虫属有两个生命期。滋养体阶段栖息于宿主动物的小肠，使用鞭毛到处移动。吸盘使滋养体附着到肠壁上，同时其以粘液分泌为食。第二生命期，孢囊，具有更坚固的外层，因此，在宿主间流通时比滋养体更加能够在宿主外部存活。通常通过被贾第虫属污染的供水(Meyer和Jarrol，见上文)，或者人对人地进行传播(Black 等人(1977) Pediatrics 60:486-491)。兰伯氏贾第虫滋养体的细胞骨架包含一组^_38kDa蛋白质(通常所说的贾第素(giardin)) (Peattie 等人(1989) J. Cell Biol. 109 :2323-2335)。几种贾第素(包括α-1-贾第素和α-2-贾第素)的核酸序列是众所周知的，α-1-贾第素和α _2_贾第素在核酸水平具有81 %的同一性，并且氨基酸序列具有77 %的同一性(Alonso和 Peattie (1992)Mol. Biochem. Parasitol. 50 :95-104)。已在兰伯氏贾第虫营养体的膜和盘上识别了 α -1-贾第素(Wenman 等人(1993) Parasitol. Res. 79 :587-592)。传统上，通过用显微镜检测粪便中的卵和寄生虫(0&P)来诊断贾第虫属感染，这是一种繁复的过程。最近开发的贾第虫属诊断方法包括抗贾第虫属抗体的血清学试验。然而，发现在血清中抗贾第虫属抗体的存在与有效的贾第虫属感染之间关连甚少。其他的诊断方法包括检测粪便样本中的贾第虫属抗原。例如，Green等人论述了通过给兔子接种完整滋养体或破裂滋养体和孢囊而建立的亲和纯化的抗血清的用途(Green等人(1985) Lancet 2 :691-693)。其他研究小组已描述了与贾第虫病患者的粪便中释放的65kDa抗原结合的单特异性抗体的用途(Rosoff 和 Stibbs (1986) J. Clin. Microbiol. 24 :1079-1083 ；U. S. Pat. No.5, 503, 983 ；Stibbs (1989)J. Clin. Microbiol. 27 :2582-2588 ；Rosoff 等人(1989) J. Clin. Microbiol. 27 :1997-2002)。Lujan 等人(1995) J. Biol. Chem. 270 :29307-29313 论述了与两种贾第虫属孢囊壁成分结合的单克隆抗体。兰伯氏贾第虫的ELISA测定法论述在，例如，Nash 等人(1987) J. Clin. Microbiol. 25 :1169-1171, Stibbs 等人(1988) J. Clin. Microbiol. 26 :1665-1669，以及 Ungar 等人(1984) J. Infect. Dis. 149 :90-97 中。先前描述的检测贾第虫属感染的测定法常常具有缺点。例如，已报道Ungar等人的测定法未能检测8%的阳性样本并且不能通过直接的目视检查而被读出(Green等人，见上文)。兰伯氏贾第虫(Giardia lamblia)是唯一已知的在人类中引起疾病的属种。一些争论仍然围绕着也与十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenal is)或肠贾第虫(Giardia intestinalis)有关的物种的分类系统(Lu 等人 1998Molecular comparison of Giardia lamblia isolates. Int. J. Parasito 1. 28 :1341-1345)。迄今描述的贾第虫属种类的其他代表为来自两栖动物的快捷贾第虫(Giardia agilis)和来自啮齿动物、禽类和爬行动物的鼠贾第虫(Giardia muris) (Meyer 1994Giardia as an organism. P 3-13. In :RCA. Thompson, J.A. Reynoldsen, A.J.Lymbery(eds. )Giardia :From molecules to disease. CAB International, Wallingford, Oxon, UK)，来自苍鹭的苍鹭贾第虫(Giardia ardea) (Erlandsen 等人 1990 Axenic culture and characterization of Giardia ardea from the great blue heron (Ardea herodias) (J. Prasitol. 76 :717-724)，以及来自廣鼠禾口田鼠的田鼠贾第虫(Giardia microti) (van Keulen等人1998)。贾第虫属小亚基rRNA的序列显示田鼠和麝鼠被一种特有的物种田鼠贾第虫(Giardia microti)寄生(J. Parasitol. 84 294-300)。单克隆抗体(mabs)是检测水样本中的贾第虫属孢囊的最重要且广泛应用的工具。绝大多数的商售抗体在其检测所有贾第虫属物种(包括不感染人类的物种)时显示出缺乏特异性。由于阳性抗体反应不会得到关于孢囊的生活力(传染性)的任何结论，所以必须将活性染色(DAPI，PI)与抗体联合使用。通过用于卵囊的排泄物涂片的光学显微镜检查或者通过使用隐孢子虫属特异性寡核苷酸引物的聚合酶链式反应(PCR)分析排泄物样本来检测隐孢子虫属。例如，在De Leon等人的第5，770，368号美国专利中公开了一种检测具硬壳形式的有活力且有传染性的隐孢子虫属的方法。该方法包括分离卵囊，诱导热休克蛋白(HSP)基因的转录，以及通过 RT-PCR检测所诱导的转录物。或者，通过在易感细胞上培养隐孢子虫属以及通过PCR从受感染细胞中扩增HSP DNA或者诱导HSP转录以及通过RT-PCR检测所诱导的转录物来测定传染性。PCR通常被认为是最灵敏和快速的检测特定样本中的病原体核酸的方法。PCR 是本领域众所周知的，并且已在Mullis等人的第4，683，195号美国专利、Mullis的第4，683，202号美国专利、AtIas等人的第5，298, 392号美国专利以及Burg等人的第 5，437，990号美国专利中描述。在PCR步骤中，提供用于每个靶病原体的寡核苷酸引物对， 其中，每个引物对包括与在所述靶核酸序列的5'末端的侧翼的序列互补的第一核苷酸序列和与在所述靶核酸序列的3'末端的侧翼的核苷酸序列互补的第二核苷酸序列。每个寡核苷酸引物对的核苷酸序列特异性针对要检测的特定病原体并且不与其他病原体发生交叉反应。有多种不可互换的实时PCR(real time PCR)平台用在临床实验室中。一些，例如，Ro本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯特尔·艾森奥尔，伊丽莎白·J·科尔曼，布莱恩·V·洛亚尔，
申请(专利权)人：肺结核诊断公司，
类型：发明
国别省市：
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