本发明专利技术涉及一种基于核酸适体结构及荧光信号转变的机制检测汞离子残留的方法，是以标记有荧光素分子的汞离子核酸适体与标记有猝灭素的互补序列构成荧光检测体系，其中：汞离子核酸适体由27~28个碱基组成的茎环结构，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，互补序列Q2的碱基序列为SEQIDNO.1；荧光检测体系检测汞离子残留的方法为：加入系列浓度的汞离子与互补序列Q2竞争结合核酸适体，根据荧光信号的变化来建立标准曲线，确定最低检出限和线性范围，然后对待测样品进行加标检测，根据标准曲线判断样品中汞离子含量。本方法快速简单，具有较高的灵敏度和选择性，样品需求量少，适用于实际样品中汞离子的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及汞离子浓度检测范围，特别是。
技术介绍
汞是环境中重金属污染的重要元凶之一，是一种具有严重生物毒性的化学物质，由于其具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，使汞成为目前最受关注的环境污染物之一，尤其是溶解态的Hg2+具有较高的化学活性和稳定性，是排入环境水体中污染物的主要存在形式，对细胞具有腐蚀性和致癌性，因此发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法进行汞离子的检测成为必要，开发和研究新的检测汞离子的材料和方法成为热点。随着指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)的发展和应用，越来越多的对祀分子具有亲和性和特异性的核酸适体从大容量的寡核苷酸库中筛选获得，研究发现，一个汞离子能特异地和两个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形成稳定的T-Hg2+-T结构，利用这一原理，已经建立了多种基于荧光信号转变的检测萊离子的方法，如Akira Ono等设计了一条富含碱基(T)的寡核苷酸序列,其5’端标记有猝灭素，3’端标记有荧光素，当汞离子存在时，由于T-Hg2+-T的结合作用而使寡核苷酸形成发夹结构并导致3’端和5’端靠近引起荧光猝灭从而对汞离子进行定量测定(Akira Ono, Humika Togashi. Angew. Chem. , 2004, 116: 4400 4402)。而 Wang Z D 也是利用T-Hg2+-T的结合原理设计了发夹结构的汞离子的寡核苷酸适体，通过荧光强度的上升定量检测汞离子(Wang Z D, Lee J H, Lu Y. Chem. Commun., 2008，45: 6005 6007)。采用源于镍离子RNA核酸适体的碱基序列合成的DNA碱基序列，再对它的部分碱基进行改造后获得新的汞离子核酸适体，并设计与该汞离子核酸适体匹配的互补序列Q2，建立新的荧光信号转变机制，利用它们检测汞离子残留，目前未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于打破之前固有的基于T-Hg2+-T结构建立的检测方法和模式，开创汞离子新型的核酸适体，并利用荧光信号转化机制建立新的检测汞离子的方法，并将其应用于环境水中汞离子检测，达到快速、简便、准确、样品需求量少的检测目的。本专利技术的目的是这样实现的一种，是以标记有荧光基团FAM的汞离子核酸适体与标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列构成荧光检测体系，其特征在于所述的汞离子核酸适体为源于镍离子RNA核酸适体的碱基序列合成的DNA碱基序列SEQ ID N0. 7中截取的第23位至第44位碱基序列，并对该部分碱基序列进行改造后获得，获得的汞离子核酸适体是由27 28个碱基组成的茎环结构，拥有碱基GGAC和GTCC共价结合形成的茎，所述互补序列Q2的碱基序列为SEQ ID N0. I ;荧光信号转变机制检测汞离子残留的方法为 a)将以标记有荧光基团FAM的汞离子核酸适体和标记有荧光猝灭基团DABCYL的互补序列Q2按照浓度比1: 2^4投放在bufferA缓冲液中，经过变性和复性，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，进行荧光检测，记录荧光强度； b)将含有不同浓度汞离子的标样分别加入含有复合物的bufferA缓冲液，经过变性和复性，萊尚子与互补序列Q2竞争结合核酸适体，以485nm为激发波长,535nm为发射波长,分别进行荧光检测，记录与不同浓度汞离子标样对应的荧光强度，建立标准曲线，确定该复合物的相关系数、最小检出限以及线性检测范围，建立与线性检测范围对应的线性方程； c)向含有复合物的bufferA缓冲液中加入待测物质，经过变性和复性，待测物质中的萊尚子与互补序列Q2竞争结合核酸适体，以485nm为激发波长,535nm为发射波长,进行突光检测，记录待测物质的荧光强度； d)将待测物质的荧光强度与线性检测范围的标准曲线进行对照，通过标准曲线确定或通过线性方程计算得到待测物质中的汞离子残留量； 所用 bufferA 缓冲液的成分为50mM NaCl+7mM MgC12+50mM Tris/HCl, bufferA 缓冲液的 ΡΗ=7· 5 ； 所述的变性和复性是指在94°C变性5分钟，然后在25°C复性30分钟。在本专利技术中，对碱基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指保留碱基序列SEQ ID N0. 7的第23位至第44位碱基，将保留段的第14位碱基A用碱基GC替换，然后在5’端增加碱基GG，在3’端增加碱基CCG，并将保留段中所有碱基U全部替换成碱基T，获得汞离子核酸适体NI，汞离子核酸适体NI的碱基序列为SEQ ID N0. 2 ；由汞离子核酸适体NI与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9993，最小检出限为O. 625ppm，线性检测范围I. 25_20ppm。在本专利技术中，对碱基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指再以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基全部替换成碱基T，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N4，其碱基序列为SEQ ID N0. 3，由汞离子核酸适体N4与互补序列Q2所构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9703，最小检出限为O. 156ppm，线性检测范围O. 3125_5ppm。在本专利技术中，对碱基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指再以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TCTTCTTGTT，再剪切SEQ ID N0. 2的剪切第28位碱基，获得汞离子核酸适体N5，其碱基序列为SEQ ID Ntj. 4，由汞离子核酸适体N5与互补序列Q2所构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9909，最小检出限为O. 078ppm，线性检测范围O. 156-2. 5ppm。在本专利技术中，对碱基序列SEQ ID N0. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指再以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TTTCCCCTTTT，再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N6，其碱基序列为SEQ ID N0. 5，由汞离子核酸适体N6与互补序列Q2所构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 9932，最小检出限为O. 156ppm，线性检测范围O. 3125_5ppm。在本专利技术中，对碱基序列SEQ ID N。. 7中的第23位至第44位碱基进行改造是指再以汞离子核酸适体NI的碱基序列SEQ ID N0. 2为基础，将SEQ ID N0. 2的第13 22位碱基替换为TTTGGGGTTTT再剪切SEQ ID N0. 2的第28位碱基，获得汞离子核酸适体N7，其碱基序列为SEQ ID N0. 6，由汞离子核酸适体N7与互补序列Q2在bufferA缓冲液中构成的复合物对汞离子残留量的相关系数为O. 958本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤金，雷兆静，张存政，刘媛，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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