一种用两端带羧基的直链亲水聚合物包被磁流体制备微纳米磁性材料的方法及其应用；具体涉及将两端为羟基或氨基的聚乙二醇或寡聚甘氨酸链与马来酸酐、琥珀酸酐反应得两端有羧基但仅有一个或两个碳碳双键的单体；用化学共沉淀法制备纳米磁芯并用带双键的短链单体分散成磁流体；在水/二辛基琥珀酸酯磺酸/正庚烷或类似微乳体系，用有两个双键的短链单体加上仅一个双键的长链单体或类似混合物、交联剂、催化剂和引发剂，自由基共聚合包被磁流体，获得表面有大量羧基的亲水微纳米磁珠；常用蛋白包括但不限于药物靶蛋白或链亲和素或免疫分析用捕获多抗、小分子配体、核酸，都可直接固定化在此磁珠上用于基于磁力生物亲和分离或靶向运送。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医用材料领域，为自由基聚合制备高分子核壳型复合材料的技术，所得材料可用于生物亲和磁力分离、磁标记检测及磁力输送，具体如磁标记免疫层析、磁分离免疫检测、磁分离筛选混合物组合库、磁分离筛选混合物中相互作用蛋白、磁靶向给药等。专利技术的
技术介绍
基于磁芯包被技术制备的微纳米超顺磁性颗粒表面连接可反应基团后可固定化生物大分子、配体或半抗原等物质，包括酶、核酸片段、抗体、抗原、半抗原等，用于痕量或微量物质的磁力分离富集实现超高灵敏度分析、磁力分离复合物筛选配体混合物、磁力pull-down筛选相互作用蛋白、磁标记免疫分析和磁共振增强显影等。用于生物领域的亚微米磁性颗粒要求表面亲水且非特异性结合低、含通过长链连接臂伸向外表面的足够多可反应基团用于固定化生物分子并有效发生生物亲和作用、悬浮稳定性好且超顺磁性强而易于磁分离、基本不含会被有机溶剂提取的杂质、耐酸碱浸蚀能力强，且不同应用可能还有特殊要求。制备满足上述生物医药应用要求的磁性微纳米颗粒即Magnetic submicronparticles (以下缩写为MSP)，目前最常用的策略是先制备含Fe4O3的磁流体，然后用亲水物质包被以降低非特异性结合，最后再添加带有所需连接臂的可反应基团用于固定化生物分子。磁流体指吸附有分散剂的磁性微粒且在液体中高度分散而形成稳定的胶体体系。磁流体的制备方法有物理法和化学法，例如研磨法、微乳液法、超声波法、气相沉积法、水热合成法、溶胶凝胶法、溶剂蒸发法、热分解法及化学沉淀法等。其中，化学沉淀法制备条件温和而广泛应用。用三价铁和二价铁溶液在剧烈搅拌下滴加碱的过程中生成四氧化三铁，在一定分散剂作用下搅拌析出，并经陈化可得磁流体。通过优化碱滴加速度、机械搅拌速度、分散剂量和陈化时间，所得纳米或亚微米磁流体可具备超顺磁性和可控的沉降速度。MSP主要制备方法为磁流体物理吸附包埋法和单体共价聚合包被法。物理吸附包埋法是将磁流体分散在高分子溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发、乳化等复合过程制得MSP ;其MSP粒径分布宽且不易控制、壳层中混有很多杂质。单体共价聚合包被法是指在磁流体和可共价聚合单体存在下，加入引发剂、催化剂等通过聚合反应而成的核/壳式MSP。共价包被磁流体外壳为高分子聚合物并分成疏水性和亲水性两类，其中亲水聚合物主要是聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙烯醇、聚乙二醇等合成聚合物，及葡聚糖、壳聚糖等天然聚合物。这些聚合物的单体通过共价聚合包被磁流体、聚合包被时诱发磁芯共沉淀、与磁芯配位等方式可制备核/壳型]\03010^1^，0.，6七 al. J. Sep. Sci. 2007 ；30,1751-1772 ；Lu A H,et al, Angew Chem Int Ed2007 ；46 :1222-1244 ；Dresco P. A.，et al. Langmuir 1999 ；15 1945-1951)。最常用且所得MSP化学组成稳定的是单体共价聚合包被磁流体的方法。据共价聚合包被磁流体所用单体的性质，制备MSP的方法又分成两类(I)用疏水单体在水包油微乳体系自由基聚合包被磁流体,通过亲水材料进行表面修饰提高生物相容性,再经复杂过程生成带有连接臂的可反应基团以固定化生物分子；(2)用生物相容性亲水聚合物在油包水微乳体系包被磁流体，经表面修饰生成带所需连接臂的可反应基团以固定化生物分子。显然，此两类MSP制备工艺都繁杂，容易带来杂质，且伴随较高的成本和很长的制备时间。 将用生物相容性好的亲水性单体共价聚合包被磁流体和添加带长链连接臂的可反应基团合二为一，通过一步聚合反应制备基本满足所有要求的MSP是更理想的制备方法(Lin, P. C. , et al. Anal Chem 2007 ；79 :3401-3408 ；Khng H P, et al. Biotech Bioeng,1998 ；60 :419-424.)。聚乙二醇(PEG)是理化性质稳定且亲水的非离子型聚合物，用其单甲醚的马来酸单酯为单体聚合包被磁流体可制备生物相容性好的磁性微球，但其表面没有可反应基团无法固定化生物分子；通常认为这种条件下来自马来酸的羧基被包埋在亲水外壳中不能暴露在表面。所以，需特殊的设计策略才能实现通过一步聚合反应制备基本满足所有要求的MSP，从而用于生物医药领域的磁标记、磁力分离与输送。理论上，一步法制备表面亲水、有带连接臂可反应基团的MSP可采用如下策略(I)用短链聚乙二醇单甲醚不饱和酸酯为单体，一端为羟基长链聚乙二醇马来酸单酯作为带连接臂和可反应基团的单体，通过油包水反相微乳法一步自由基共聚反应包被磁流体，用有机溶剂等反复洗涤去除小分子杂质，活化连接臂末端羟基或转变成羧基、氨基等可在温和条件下固定化常见生物分子。但此法所得MSP尽管亲水性、非特异性结合、悬浮稳定性、顺磁性、粒径等满足要求，但表面可反应基团太少，不能固定化足够多的生物分子。(2)用不同长度PEG与马来酸酐反应获得以聚乙二醇为骨架、马来酸为碳碳双键和羧基来源的两端都含有羧基和碳碳双键的亲水单体；同时以长链PEG与马来酸酐及琥珀酸酐分别反应获得两端含羧基但仅一端含有碳碳双键的长链亲水单体；两种单体恰当比例混合后，油包水反相微乳体系一步自由基共聚反应包被磁流体制备表面带大量羧基的亲水性MSP。亚微米乳液由表面活性剂、助表面活性剂及水组成各面同性的热力学体系，其大小可控在几十至几百纳米之间。在此特殊的微环境中，可进行多种化学沉淀反应或聚合包被磁流体制得包被颗粒，其大小决定于反应微环境的大小，故调节油水比例和表面活性剂的量可控制粒径。为保证有足够多的羧基伸向MSP表面用于固定化生物分子，需优选水包油乳液体系和长短链单体及其比例；同时，控制微水相的PH让足够比例的羧基电离增大相互之间的排斥，驱动部分羧基分布到MSP表面而使得其表面亲水且抗聚集；但此微水相pH不能过高，否则太多羧基电离后会降低单体的聚合反应速度而降低MSP收率，同时MSP的外壳抗外部酸碱浸蚀的能力下降而组成不稳定；为了降低表面可反应羧基周围的空间位阻以便于固定化生物分子后参与生物亲和作用，需优化生成连接臂单体的长度，其长度要比生成外壳单体足够长，伸向表面羧基的空间位阻才能足够小。获得满足基本要求的表面有丰富羧基的MSP后，此羧基可活化成活泼酯或进一步转化成氨基，以固定化带有氨基或羧基的常见生物分子。各种水溶性蛋白质、带有可反应基团的核酸、多糖、各类小分子配体或半抗原等，都可经恰当反应直接固定化在本专利技术技术所制备的MSP上，用于磁力分离分析或磁力输送。链亲和素或亲和素可以固定化在所得MSP上作为通用生物亲和分离材料，其它蛋白质也可直接固定化在此类MSP表面用于发生生物亲和作用。使用此类MSP时不必预先包被蛋白质提高亲水性再间接固定化目标蛋白质，即不依赖于生物素修饰后与MSP表面的链亲和素或亲和素结合间接固定化或分离，这可显著降低磁分离和磁标记的成本。用针对靶蛋白融合表达标签谷胱甘肽-S转硫酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或组氨酸标签的亲和标记试剂固定化在此类MSP上，还可位点选择性地共价固定化融合表达的革巴蛋白，用于混合物 组合库的筛选(Yang XL, et al, BMC Biotechnol本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖飞，杨晓兰，龙高波，蒲军，刘红博，李元丽，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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