一种分离外泌体的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种分离外泌体的方法及其试剂盒。本发明专利技术提供试剂如下试剂：亲水聚合物水溶液或盐溶液，所述亲水聚合物为PEG、硫酸葡聚糖或PVP或其组合物；本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术用多种利用亲水类聚合物能成功分离外泌体，用亲水聚合物和无机盐配合能提高分离外泌体的收率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种分离外泌体的方法及其试剂盒。
技术介绍
外泌体是细胞向胞外空间分泌的小囊泡(通常约30-100纳米)，不同来源外泌体大小有差异。所有类型的培养细胞都能分泌外泌体，且在体液如血液、尿液、唾液和母乳中含量丰富(Kosakaetal.,Silence3(2010)1-7；Mitchelletal.,PNAS105(2008)10513-10518)，且外泌体可通过体液循环等途径到达其他细胞或组织。外泌体中包含核酸，蛋白、脂类等多种生物分子，并可能是这些物质在体内转运的载体。相关研究认为外泌体可能扮演了信使的角色，其通过在细胞间传递各种信号分子，参与细胞间通讯，从而调控多种生理过程，包括肿瘤发生与转移、心脏病、免疫性疾病等，因此外泌体具有很好的药物释放系统开发潜力，其内含或膜上的核酸、蛋白、脂类、酶等物质也可能成为疾病诊断治疗的标志物。但目前对外泌体及其内含物的产生途径和功能作用的了解仍不充分，因此迫切需要一种能高质和高效获得外泌体及其内含物的方法，以提供大量的高质的外泌体，作为深入研究外泌体功能机制与以及将其应用于疾病诊断或基因治疗的基础。目前分离外泌体的方法有超速离心法和超过滤法。超速离心法主要利用外泌体大小、密度等与周围环境物质的差异进行分离，其缺点是对离心设备要求高，成本高；需反复离心，操作步骤复杂；离心力大，可能破坏外泌体结构，因此获得的外泌体收率不高。而超过滤法则是利用外泌体的尺寸特征而从周围环境中分离出来，其解决了超速离心法耗时长、要求特殊设备的缺陷，但由于周围环境中可能存在与其尺寸范围相同的其他物质，因此分离的外泌体纯度不高。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种分离体液或细胞上清液或组织样本中外泌体的试剂。本专利技术提供的试剂，为亲水聚合物或亲水聚合物溶液。上述试剂中，所述亲水聚合物为如下3种中至少一种：PEG(聚乙二醇)、硫酸葡聚糖和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。上述试剂中，所述亲水聚合物溶液为水溶液、盐溶液或有机溶液。所述亲水聚合物溶液中，所述亲水聚合物浓度为10mg/ml-300mg/ml。上述试剂中，所述PEG的分子量为6000-20000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为30000-50000道尔顿，所述PVP的分子量为20000-40000道尔顿；或所述PEG的分子量具体为8000或20000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量具体为40000道尔顿，所述PVP的分子量具体为25000道尔顿或40000道尔顿。上述试剂为如下1)-3)中任一种：1)亲水聚合物组或亲水聚合物水溶液组；所述亲水聚合物组或所述亲水聚合物水溶液组中的亲水聚合物为如下至少2种：PEG8000、PVP25000、PEG20000和硫酸葡聚糖40000；2)亲水聚合物盐溶液，所述亲水聚合物盐溶液由溶质和溶剂组成，所述溶质由亲水聚合物和无机盐组成；所述亲水聚合物为PEG8000或PEG20000；3)亲水聚合物或其水溶液，所述亲水聚合物为PEG8000、PEG20000、硫酸葡聚糖40000、PVP25000或PVP40000。上述试剂中，1)所述亲水聚合物组或亲水聚合物水溶液组为如下：PEG8000和PVP25000；或PEG8000水溶液和PVP25000水溶液；或PEG20000和硫酸葡聚糖40000；或PEG20000水溶液和硫酸葡聚糖40000水溶液；2)所述亲水聚合物盐溶液为PEG8000盐溶液或PEG20000盐溶液；所述PEG8000盐溶液的溶质由PEG8000和NaCl组成；所述PEG20000盐溶液的溶质由PEG20000和NaCl组成。上述试剂中，所述体液为血浆或血清或尿液或胸腔积液或脊髓液或脑髓液或唾液或乳液或关节液或精液或阴道液或羊水，所述细胞上清液源自肿瘤细胞或炎性细胞或实质细胞或间质细胞或上皮细胞或纤维细胞或成纤维细胞，所述组织为肝或肺或脑。所述细胞上清液源自3T3细胞或A549细胞或293细胞或Hela细胞。本专利技术的另一个目的是提供一种分离体液或细胞上清液或组织样本中外泌体的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括上述的试剂；或上述的试剂或所述的试剂盒在分离体液或细胞上清液或组织样本中外泌体中的应用也是本专利技术保护的范围；或上述的试剂或所述的试剂盒在制备分离体液或细胞上清液或组织样本外泌体中的应用也是本专利技术保护的范围；上述中，所述体液具体为血浆或血清或尿液或胸腔积液或脊髓液或脑髓液或唾液或乳液或关节液或精液或阴道液或羊水，所述细胞上清液具体源自肿瘤细胞或炎性细胞或实质细胞或间质细胞或上皮细胞或纤维细胞或成纤维细胞，所述组织具体为肝或肺或脑。所述细胞上清液具体源自3T3细胞或A549细胞或293细胞或Hela细胞。本专利技术第三个目的是提供一种分离体液或细胞上清液或组织样本外泌体的方法。本专利技术提供的方法包括如下步骤：将体液或细胞上清液或组织样本分别与上述试剂混匀，得到混合液，使所述试剂中的亲水聚合物在混合液的浓度达到工作浓度，再将所述混合液静置，静置后收集沉淀，即得到外泌体。上述方法中，采用的所述试剂及所述试剂中的亲水聚合物的工作浓度如下：所述PEG8000水溶液和所述PVP25000水溶液的混合液；所述PEG8000工作时的浓度为50mg/ml，且所述PVP25000工作时的浓度为150mg/ml；或所述PEG20000水溶液和所述硫酸葡聚糖40000水溶液的混合液；所述PEG20000工作时的浓度为150mg/ml，且所述硫酸葡聚糖40000工作时的浓度为50mg/ml；或所述PEG8000盐溶液，所述PEG8000工作时的浓度为150mg/ml，且所述NaCl工作时的浓度为0.5M；或所述PEG20000盐溶液，所述PEG20000工作时的浓度为150mg/ml，且所述NaCl工作时的浓度为0.5M；或所述PEG8000水溶液，所述PEG8000工作时的浓度为150mg/ml；或所述PEG20000水溶液，所述PEG20000工作时的浓度为150mg/ml；或所述硫酸葡聚糖40000水溶液，所述硫酸葡聚糖40000工作时的浓度为50mg/ml；或所述PVP25000水溶液，所述PVP25000工作时的浓度为200mg/ml；或所述PVP40000水溶液，所述PVP40000工作时的浓度为150mg/ml；所述体液具体为血浆或血清或尿液或胸腔积液或脊髓液或脑髓液或唾液或乳液或关节液或精液或阴道液或羊水，所述细胞上清液具体肿瘤细胞或炎性细胞或实质细胞或间质细胞或上皮细胞或纤维细胞或成纤维细胞，所述组织具体为肝或肺或脑。所述细胞上清液具体源自3T3细胞或A549细胞或293细胞或Hela细胞。PEG为聚乙二醇，PVP为聚乙烯吡咯烷酮，PEG和PVP后的数字表示其相对分子量。所述细胞上清液为细胞培养液的上清。所述收集沉淀为离心，离心的离心力为500g-15000g。所述体液或细胞上清液或组织样本与上述试剂的体积比为7：1-1：1；所述上述试剂中，所述亲水聚合物浓度为10mg/ml-300mg/ml。在所述方法中，对分离得到外泌体进行进一步检测和/或在溶液混匀之前对待测样本进行处理；所述检测包括核酸检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离体液或细胞上清液或组织样本中外泌体的试剂，为亲水聚合物或亲水聚合物溶液。

【技术特征摘要】
1.一种分离体液或细胞上清液或组织样本中外泌体的试剂，为亲水聚合物或亲水聚合物溶液。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述亲水聚合物为如下3种中至少一种：PEG、硫酸葡聚糖和PVP。3.根据权利要求1或2所述试剂，其特征在于：所述亲水聚合物溶液为水溶液、盐溶液或有机溶液；所述亲水聚合物溶液中，所述亲水聚合物浓度为10mg/ml-300mg/ml。4.根据权利要求2所述试剂，其特征在于：所述PEG的分子量为6000-20000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量为30000-50000道尔顿，所述PVP的分子量为20000-40000道尔顿；或所述PEG的分子量具体为8000或20000道尔顿，所述硫酸葡聚糖的分子量具体为40000道尔顿，所述PVP的分子量具体为25000道尔顿或40000道尔顿。5.根据权利要求1-4中任一所述试剂，其特征在于：所述试剂为如下1）-3）中任一种：1）亲水聚合物组或亲水聚合物水溶液组；所述亲水聚合物组或所述亲水聚合物水溶液组中的亲水聚合物为如下至少2种：PEG8000、PVP25000、PEG20000和硫酸葡聚糖40000；2）亲水聚合物盐溶液，所述亲水聚合物盐溶液由溶质和溶剂组成，所述溶质由亲水聚合物和无机盐组成；所述亲水聚合物为PEG8000或PEG20000；3）亲水聚合物或其水溶液，所述亲水聚合物为PEG8000、PEG20000、硫酸葡聚糖40000、PVP25000或PVP40000。6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：1）所述亲水聚合物组或亲水聚合物水溶液组为如下：PEG8000和PVP25000；或PEG8000水溶液和PVP25000水溶液；或PEG20000和硫酸葡聚糖40000；或PEG20000水溶液和硫酸葡聚糖40000水溶液；2）所述亲水聚合物盐溶液为PEG8000盐溶液或PEG20000盐溶液；所述PEG8000盐溶液的溶质由PEG8000和NaCl组成；所述PEG20000盐溶液的溶质由PEG20000和NaCl组成。7.根据权利要求1-6中任一所述试剂，其特征在于：所述体液为血浆或血清或尿液或胸腔积液或脊髓液或脑髓液或唾液或乳液或关节液或精液或阴道液或羊水，所述细胞上清液源自肿瘤细胞或炎性细胞或实质细胞或间质细胞或上皮细胞或纤维细胞或成纤维细胞，所述组织为肝或肺或脑。8.一种分离体液或细胞上清液或组织样本中外泌体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张必良，曹亮，刘建世，
申请(专利权)人：广州市锐博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44