本发明专利技术公开了一种四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及应用，该基因可编码四氢嘧啶合成酶，并在宿主细胞中高效表达以生产四氢嘧啶合成酶，使含有该基因的工程菌结构稳定、性能优良、耐盐性高，处理高盐废水无需驯化，降低了高盐废水处理成本，简化了生产工艺，可广泛应用于日化、食品加工、皮革加工、有机合成和药物制备等行业中高盐废水的处理，意义重大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及涉及一种四氢嘧啶合成酶基因、重组载体、重组工程菌及其应用，属于酶的基因工程领域。
技术介绍
四氢嘧啶作为相容性溶质于1粥5年在极端嗜盐菌to thiorhodospirahalochloris 中被(ialinski等所发现并且鉴定结构，1988年hbar等又在革兰氏阳性土壤细菌 Streptomycesparvulus中发现了四氢嘧啶的羟基化衍生物羟基化四氢嘧啶。四氢嘧啶类相容性溶质(ectoinesEcs)是嗜盐菌中最普遍存在的相容性溶质之一，能够为处于外界高温、冷冻、射线、干燥等极端条件刺激下的细胞、蛋白质、细胞膜、和核酸提供保护作用，因此受到各国研究者的广泛关注。此外Ecs对阿尔兹海默氏症、帕金森病等神经性疾病均有一定的疗效，并且最新研究发现Ecs能够提高皮肤的再生能力和延缓皮肤的老化。因此，Ecs 在精细化工、生物医药及生物制造等行业将具有广泛的应用前景。目前处理高盐废水常用的是物化法+生化法的水处理工艺，该工艺流程繁琐，工艺参数要求严格，操作困难，处理效率低，运行成本高，废水处理过程中产生大量有毒有害固废很难处理。经过该工艺处理后的废水很难达到国家的直排标准。据现有报道来看，对高盐废水直接采用生物法处理，在企业的实际应用中少有成功案例。生物法处理虽然在工艺流程以及成本投入方面有很大优势，但由于此种废水的高盐以及极强的杀菌抑制能力， 使得其对微生物的杀伤力极大，因此，寻找一种能应用于工业生产的处理高盐废水的微生物是目前高盐废水处理行业所关注的焦点。近几年，国内外学者对微生物四氢嘧啶合成酶的基因工程研究做了大量工作，并取得了很多重要成果。斯图加特大学根据ES的基因序列、蛋白质结构等的研究情况整理了一个ES酶工程数据库对ES酶相关信息进行了不同的分类。目前为止已克隆了包括微生物和动植物在内的众多ES酶基因，在NCBI中已报道的ES酶基因已达1000余个(包括假单胞菌、酵母菌、葡萄球菌、链霉菌和枯草杆菌等众多微生物来源的)；而且仍在迅猛增加。由于ES酶基因氨基酸序列具有较低相似性，即不同种甚至同种不同属的微生物之间的ES酶基因序列也存在较大的差异，所以ES酶基因的克隆存在较大难度。目前关于 ES酶基因的克隆策略有以下几种(1)通过构建DNA/mRNA文库克隆ES酶基因直接将待克隆基因的基因组酶切后回收带有ES酶的基因片段，转化到五coli中构建基因组文库，在罗丹明B平板上筛选阳性克隆。( RACE的方法。分别通过3' RACE和5' RACE，经过两轮 PCR，获得基因全长；(3)直接从已知序列设计引物PCR克隆ES酶基因根据序列同源性比较，参考已报道出发菌株ES酶基因序列设计引物，以基因组DNA为模板直接进行PCR扩增目的ES酶基因片段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种四氢嘧啶合成酶基因、含有该基因的重组载体和重组工程菌。本专利技术的另一个目的是提供该重组工程菌的应用，本专利技术所述基因为耐盐基因， 将该基因转入菌株制得的工程菌耐盐性大大提高，在处理高盐废水中具有重要应用。本专利技术是通过以下措施实现的一种四氢嘧啶合成酶基因，具有SEQ NO 1所示的核苷酸序列。本专利技术四氢嘧啶合成酶基因的得到方法与常规方法略有不同，以前期筛选到的耐盐菌株芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组为模板，通过简并引物PCR与反向PCR(IPCR)相结合的方法，扩增得到了编码完整的ES酶基因的ORF框，该基因全长414bp，编码137个氨基酸，序列如SEQ NO :1所示。具体方法如下1、根据四氢嘧啶合成酶的氨基酸序列，设计简并引物序列上游引物 5’ -GGNTTYWSNTTYCAYATHACN-3 ‘下游引物 5，-NGGRTTRAANACRCA-3，2、以芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组为模板，进行PCR扩增获取ES酶基因，其反应体系为10X buffer5. 0 MLdNTPs (2. 5 mM)4.0 yL上游引物(50 mM)1.0 yL下游引物(50 mM)1.0 yLTaq DNA polymerase0. 5 μ L芽孢杆菌(Bacillaceae)基因组1.0 μΗ,Ο37. 5 μ L反应条件为预变性94°C，5min ；变性温度94°C，Imin ；退火温度57°C，Imin ； 延伸温度72°C，1. 5min，循环32次。根据上述四氢嘧啶合成酶基因，可编码四氢嘧啶合成酶，其氨基酸序列如SEQNO 2所示。本专利技术还提供了含有该基因的重组载体(即重组表达载体，下同)，重组载体的构建方法为将以芽孢杆菌基因组为模板扩增得到的含有限制性内切酶(EcoRI与NotI)酶切位点的ES酶基因与T载体pBST相连得到pBST-ES，然后将表达载体pIC9K与pBST_ES分别进行双酶切，酶切后的基因片段与质粒PIC9K进行连接并转化进大肠杆菌，提取质粒然后用Bg II线性化处理，得到重组载体，命名为PIC9K-ES。将上述线性化的重组载体pIC9K-ES转入目的降解菌株中，可以得到含有ES酶的重组工程菌，本专利技术所用的降解菌株Oceanobacillus sp. CJ-IO是从工厂废水车间的生物处理池及工厂生产车间周边土样中富集、筛选得到的，专利技术人已经将降解菌株和重组工程菌进行了保藏，降解菌株Oceanobacillus sp. CJ-10，保藏号为CGMCC NO. 4328，保藏日期为2010年11月12日；重组工程菌Oceanobacillus sp. CJ-10-1的保藏号为CGMCC NO. M63，保藏日期为2011年11月16日，他们均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本专利技术的重组工程菌实现了该基因的高效表达，本专利技术的重组工程菌有以下特点(1)表达量高由于醇氧化酶基因启动子很强，细胞生长速度很快，所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高；( 稳定性好由于该系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在，而是整合在染色体上，所以构建的菌株十分稳定；C3)分泌量大分泌信号和先导序列(如α因子)使其分泌表达可达10g/L，这在ES酶的生产过程中十分少见；(4)容易放大；( 成本较低重组蛋白在目的降解菌株中的表达比在昆虫和哺乳动物中表达成本要低，生产和表达基质不需要象牛血清白蛋白那样昂贵的添加物，也不需要(X)2培养箱和组织培养箱等昂贵的设备。本专利技术还提供了含有该基因的重组工程菌的应用，具体的是在处理高盐废水中的应用，所述废水含盐量在12wt%以下，酚含量在2500mg/L以下，COD在10000mg/L以下，废水中含有苯酚、2，4-二氯苯酚、氯乙酸和2，4-D酸中的至少一种。经重组的菌株具有很高的耐盐性和稳定性，大大降低了废水处理成本，大大提高了废水处理效率。采用重组工程菌处理高盐废水的工艺流程如图5所示，方法为(1)含盐含酚废水进入调配池，调节废水中的C0D、N和P的含量，同时将废水温度调节至15-35°C，pH调节至7. 5-9. 5，盐含量调节为l_12wt% ；(2)废水进入生物处理设备进行生物降解，处理后废水中COD< 200mg/L，.< OJmg/ L，所述生物处理设备包括依次连接的一级厌氧生物滤池、二级厌氧生物滤池、一级好氧生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙国庆，李志清，陈蕾，凌晓光，
申请(专利权)人：山东潍坊润丰化工有限公司，
类型：发明
国别省市：
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