肠道病毒71型单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种肠道病毒71型单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体来源于EV71病毒杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC?No.5330。本发明专利技术的单克隆抗体及其相关试剂对于推动我国EV71病毒所致的重症与死亡病例的治疗与研究有重要意义，对进一步推进EV71的临床研究、流行病学发展以及被动治疗具有极其重要的价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒免疫生物医学领域，具体地说，涉及一种肠道病毒71型单克隆抗体及其应用。
技术介绍
手足口病(Hand，foot and mouth diseases，HFMD)是一种全球范围内广泛流行的粪口传播的疾病，世界上大部分地区均有此病流行的报导。长期以来，轻度的手足口病在世界范围内周期性爆发。该病于1957年在新西兰首次报道，1958年首次分离出柯萨奇病毒， 1959年提出手足口病的名称。1969年美国从中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出肠道病毒71 (EV71病毒)，该病毒被首次确认。手足口病流行的间隔期为2-3年，早期的病原体以Cox A16型为主，后来EV71与Cox A16交替出现，成为手足口病的主要病原体。20 世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行。1994年英国暴发了 Cox A16引起的手足口病。20世纪90年代后期，EV71在亚太地区的流行呈逐年上升趋势，由此引起的手足口病在东南亚地区广泛流行，感染后常导致患者发生严重的中枢神经系统症状，死亡率较高。 1997年马来西亚爆发主要由EV71引起的手足口病，4-6月间共四例病人死亡。1998-2001 年手足口病在新加坡大量流行。在我国，1981年上海首次报道HFMD ；此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等十几个省市均有该病的报道。1983年天津暴发了 Cox A16引起的手足口病，5-10月间发生了 7，000余病例；经过2年低水平散发后，1986年再次暴发。1995年武汉病毒研究所从手足口病病人中分离出EV71病毒，1998年深圳市卫生防疫站从患者标本中分离出EV71病毒。1998年台湾暴发了大规模的EV71疫情，发病人数估计达150万，其中重症405例，死亡78例，大多为5岁以下的幼儿。我国2000年80，677 人感染HFMD，重症感染者例，死亡41例；2001年出现389例重症感染者，55人死亡。手足口病已经越来越成为威胁国内儿童健康的广泛流行性疾病之一。2007年至今，该病在我国不断流行；山东临沂、青岛和济南、安徽阜阳等地均发生以EV71为主要病原体导致的手足口病的流行。HFMD为自限性疾病，在婴幼儿中传播，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等致死性并发症。EV71与Cox A16是导致HFMD的两种最主要的病原体；其中EV71占HFMD重症病例的90%左右，占死亡病例的 80%左右。EV71属于微小核糖核酸病毒科肠道病毒属，为单股正链RNA，含7000多个核苷酸，包括一个开放阅读框，编码VP1-VP4四个病毒结构蛋白。VPl是主要的衣壳蛋白与病毒中和决定因子，具有最多的型特异性中和位点，负责病毒与靶细胞的结合，决定着病毒的抗原性，其基因序列与病毒血清型具有较高的相关性，根据VPl的全基因序列，将EV71分为A、 B和C型3个基因型。目前用于检测EV71病毒的方法主要有RT-PCR法和荧光定量PCR法。上述方法特异性较好，但是灵敏度差，试验容易发生污染出现假阳性和假阴性结果。同时病毒在传播过程中存在一定核苷酸突变的几率，因此引物设计是个问题。同时试验费用高，需要许多大型仪器设备和熟练的技术人员，操作复杂，检测时间长，不易在我国推广使用。疫苗作为疾病的有效预防手段，其有效性得到了世界公认。但是疫苗生产过程中病毒需经过灭活、纯化去除杂质等一系列步骤，其有效成分的检测是指导疫苗研发与成败的关键点。检测病毒抗原常采用ELISA法，该方法以灵敏性度高和特异性好的特点在很多病毒检测中发挥重要作用。EV71抗原ELISA检测关键是有特异性好的抗EV71抗体，以保证检测试剂的特异性，同时抗体需要有稳定来源具有稳定的细胞株，并且抗体需要高效价、高中和活性，以确保检测的抗原为活性表位抗原。同样，对于EV71感染的早期发现，EB71流行病学调查来说，EV71抗体检测也存在上述类似问题。因此为了抑制病毒的传播扩散，进行疾病监测，病毒的鉴别试验，以及疫苗研制过程中病毒抗原表位的检测，有必要开发针对 EV71病毒的具有广泛高度活性与中和活性的单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述
技术介绍
上的问题，制备一种抗EV71的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。专利技术人采用EV71灭活病毒作为抗原利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，然后通过间接ELISA法筛选单抗细胞株，并对筛选的单克隆抗体进行中和试验，获得了能分泌中和 EV71病毒A、B、C三种基因型的可特异性结合EV71病毒的细胞系，以及由所属细胞系产生的单克隆抗体。为了实现本专利技术目的，本专利技术一方面提供了一种对EV71病毒各基因型均有较高反应性和中和活性的杂交瘤细胞株。其制备方法是采用常规技术将源自于EV71纯化液免疫接种的鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，选择产生抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞。对于本专利技术的上述杂交瘤细胞株，申请人于2011年10月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)对其进行了保藏，保藏号为CGMCC No. 5330(对应的本专利技术的编号为A9)。本专利技术的另一方面提供了由上述杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体。进一步的，本专利技术的抗体可根据其抗原结合区域(例如重链和轻链可变区)发展出的各种衍生抗体，可以用于被动免疫治疗或预防EV71病毒感染，优选人源化抗体。更进一步的，本专利技术提供了一种用于治疗和/或预防EV71感染的方法，其中包括将本专利技术所述的单克隆抗体。再进一步的，本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备检测EV71病毒三基因型的抗原的试剂、药剂或试剂盒中的应用。本专利技术的再一方面，提供了用于检测EV71病毒的试剂、药剂或试剂盒，其包括本专利技术所述的单克隆抗体。所述试剂、药剂或试剂盒用于检测EV71病毒抗原，从而进一步用于诊断EV71病毒感染。本专利技术的再一方面，还提供了用于检测EV71抗体的试剂、药剂或试剂盒，其包括本专利技术所述的单克隆抗体。所述试剂、药剂或试剂盒用于检测抗EV71病毒IgG、IgM抗体， 从而进一步用于诊断EV71病毒感染。所述EV71病毒选自A、B、C三种基因型的EV71病毒，优选地，本专利技术所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型 EV71病毒。进一步的，所述试剂、药剂或试剂盒优选包括标记的本专利技术的单克隆抗体。所述的标记，其是指生物标记或化学标记，优选荧光标记、放射性标记或酶标记，更优选辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记或荧光素标记。本专利技术的又一方面提供了一种用于治疗和/或预防EV71感染的药物，其包括上述的单克隆抗体。所述药物优选为进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。本专利技术的又一方面提供了一种用于治疗和/或预防EV71感染的疫苗，其包括上述的单克隆抗体。本专利技术的又一方面提供了一种治疗和/或预防EV71感染的方法，其中包括将本专利技术所述的单克隆抗体施用于患者。本专利技术的还一方面提供了用于检测EV71抗原的方法，其中使用了本专利技术所述的单克隆抗体，或标记的本专利技术的单克隆抗体。优选的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡芳，高强，王琳，薛晨宝，张立志，尹卫东，
申请(专利权)人：北京科兴生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：