本发明专利技术公开了鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株、其构建方法及应用。本发明专利技术的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株rMSΔMeq株，微生物保藏号是：CGMCC?No.4612，其是在亲本毒株MDV?MS株的基础上，经两次同源重组缺失主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp碱基序列而得到。本发明专利技术还涉及该基因缺失疫苗株在制备防治鸡马立克氏病药物中的应用以及针对该基因缺失毒株的缺失基因序列研制的可用于区分疫苗毒株与鸡马立克氏病毒野毒株的检测及诊断方法。本发明专利技术基因缺失疫苗株安全性好，对于鸡马立克氏病具有良好的免疫保护效力，可应用于制备防控鸡马立克氏病病毒的单苗或联苗等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种由于基因缺失得到的弱毒疫苗株，尤其涉及鸡马立克氏病病毒 Meq基因缺失疫苗株，还涉及其在制备防治鸡马立克氏病药物中的应用，属于生物医药领域。
技术介绍
鸡马立克氏病(MD，Marek' s Disease)是由感染马立克病毒(MDV，Marek' s Disease virus)引起的，是一种严重危害养禽业发展的高度传染性、肿瘤性疾病。该病可引起鸡发生多发性淋巴瘤，导致鸡只衰竭、死亡。同时损伤鸡体的免疫器官，产生严重的免疫抑制，易并发其他疾病。该病病程较长，并且发生该病后常导致整个鸡群的淘汰，一旦发生该病，损失往往特别巨大。疫苗是控制该病的主要手段，在种鸡群、蛋鸡群中MD疫苗是必须使用的疫苗，肉鸡群中使用该疫苗可以较大幅度地提高养殖效率。MD的病原-马立克氏病毒(MDV)毒力呈不断演化的趋势。近些年，随着MDV更强毒力毒株的出现，尤其是特超强毒的出现，现有的疫苗毒株，包括广泛应用的HVT、CVI988疫苗株不能对其进行良好的保护。 在我国不同地区的养鸡场中，MD疫苗免疫鸡群常有MD的发生。最近的报道表明，即使应用最新型的MDV疫苗，一些MDV强毒株也能引起免疫鸡群发生接近50%的MD死亡率。我们研究组最近几年连续从现地MD免疫失败的养鸡场分离到20多株MDV强毒株，对其中部分毒株的免疫攻毒试验表明，有些毒株可以突破HVT疫苗、HVT+SB1双价疫苗以及血清1型的CVI988疫苗的免疫保护，证明我国流行的MDV野毒的毒力在逐步的提高， 现有的所有MD疫苗均不能提供有效保护。因此，迫切需要研制新的MD疫苗毒株，以便有效防控MDV。MDV缺失某一基因后致肿瘤性丧失，而它的复制能力没有被破坏，以这种病毒研制的MD疫苗，它的免疫保护能力将非常高。近几年MDV功能基因的研究进展很快，Jarosinski 等缺失MDV RBlB株细菌人工染色体(BAC)的RL0RF4基因，发现缺失后的RBIB株在体内外的毒力减弱；Silva等将Md5株的2拷贝132bp重复序列缺失，与亲本病毒以相同方式接种SPF鸡，也无毒力减弱趋势。Reddy课题组为了研究Meq基因功能，将Md5株的Meq基因去除，构建了一株Meq基因缺失株rMd5AMeq。缺失株在体外生长稳定，同时也证明了 Meq 基因在淋巴细胞感染期是非必需的。其免疫保护效果强于现用商业化疫苗株CVI988，无论是实验室人工攻毒试验还是模拟田间试验，都能诱发高水平的免疫反应，能够抵抗Md5 (vv) 和648A(w+)的攻击。针对不同增殖能力的野毒株缺失Meq基因有很高的研究价值。目前重组MDV的构建多采用BAC技术-是将BAC载体插入至病毒基因组非必需位点，构建病毒感染性克隆。该方法也存在一些缺点，一是在病毒基因组中插入了外源基因 (BAC成分)，存在潜在的不利因素。二是病毒基因组在操作过程中，需要在原核细胞中增殖和扩增。由于MDV病毒基因组很大，在原核系统中增殖更易导致基因突变。本研究是在分析近年来本实验室从现地分离到的多株MDV流行毒株的生物学特性的基础上，选择MDV MS株为亲本毒株，采用基因工程手段，通过两次同源重组的方法获得了重组病毒株-rMSAMeq。该构建重组病毒的方法避免了采用BAC技术带来的一些不利影响。该毒株对鸡具有良好的安全性；以该毒株免疫接种鸡，可以提供高效的抗MDV免疫保护作用。该疫苗株的另外一个重要特点是带有基因缺失的遗传标记，可以据此区分疫苗毒株和野生毒株，有利于鸡群的MDV感染检测和免疫监控。同时，该基因缺失疫苗株也具有制备以其为活病毒载体构建表达其他外源蛋白的重组病毒的用途。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有弱毒疫苗的不足，提供一种可以有效预防鸡马立克氏病，并具有分子标记，利于免疫鸡群的野毒感染和免疫监控的新的鸡马立克氏病基因缺失疫苗株。用该疫苗株所制备的疫苗对目前我国流行的鸡马立克氏病病毒可以提供良好的免疫保护效果。本专利技术所要解决的技术问题之一是提供了一种构建鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，本专利技术的方法其特征在于所述的Meq基因缺失疫苗株是在亲本毒株 MDV MS株的基础上经两次同源重组得到的，第一次同源重组是在亲本毒株MDV MS株的基础上通过插入报告基因IacZ并同时替换主要致瘤基因Meq基因的前半部分的468bp的碱基序列得到中间体病毒株；后经第二次同源重组去掉中间体病毒株中插入的报告基因，即得所述的Meq基因缺失疫苗株，所述的Meq基因的前半部分468bp的碱基序列如SEQ ID NO. 1 所示。在本专利技术的一个具体实施例中，构建鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，具体的包括以下步骤(1)转移载体的构建参照已发表的MDV强毒GA株相关基因序列，GeneBank登录号为No. AF147806，针对Meq基因两侧的片段A、B分别设计了引物对I^rimer A和I^rimer B，片段A、B作为构建转移载体质粒的同源序列；所述的引物对Primer A和Primer B序列如下所示Primer A 上游引物5 ‘CCGGCATGCGCCCTCCGTATAATGTAAAT 3，下游引物5 ‘GTCGACTGCCCGCCTTCTCCCTGGTAT 3，Primer B 上游引物5 ‘GTCGACACTCCTCCACCTCCCTCAC 3，下游引物5 ‘GCGAGCTCGAATGTCCATCCTGTTATCT 3，以MDV MS株基因组DNA为模板，通过PCR方法获得Meq基因片段A，经Ml I和 Sph I酶切，与pUC19连接，得到质粒pUCA ；PCR扩增得到Meq基因片段B,经Sal I和Sac I酶切后，连接到PUCA中，得到质粒pUCAB ；经Mil酶切得到的LacZ表达基因盒，连接到 pUCAB质粒中，得到质粒pALadB ；(2)第一次同源重组MDV MS株基因组总DNA与转移载体质粒pALadB共转染鸡胚成纤维细胞，在亲本毒株MS株的基础上通过插入报告基因IacZ并同时替换主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp的碱基序列得到鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株，所述的Meq基因的前半部分468bp的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示；(3)第二次同源重组采用经第一次同源重组得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株的基因组总DNA与转移载体质粒pUCAB共转染鸡胚成纤维细胞，筛选得到去掉中间体病毒株中插入的报告基因的Meq基因缺失疫苗株，即得所述的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。其中所述的亲本毒株MDV MS株(参见文献马立克氏病病毒miRNA缺失株的构建及其体外生长规律，杨文闯、刘长军等，中国兽医科学.2011,41 (03))由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室保存提供。)该毒株的特点是(1)对鸡具有较高致病性；( 在鸡体内、外的增殖能力强；C3)感染鸡只后，鸡只发病时间早。本专利技术所要解决的技术问题之二是提供了由所述的方法制备得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。及由所述的方法制备得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株。通过本专利技术的具体实施例得到了一株所述的基因缺失疫苗株，命名为rMSAMeq， 建议的分类命名为禽疱疹病本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种构建鸡马立克氏病病毒Ｍｅｑ基因缺失疫苗株的方法，其特征在于：所述的Ｍｅｑ基因缺失疫苗株是在亲本毒株ＭＤＶ ＭＳ株的基础上经两次同源重组得到的，第一次同源重组是在亲本毒株ＭＤＶ ＭＳ株的基础上通过插入报告基因ｌａｃＺ并同时替换主要致瘤基因Ｍｅｑ基因的前半部分的４６８ｂｐ的碱基序列得到中间体病毒株；后经第二次同源重组去掉中间体病毒株中插入的报告基因，即得所述的Ｍｅｑ基因缺失疫苗株，所述的Ｍｅｑ基因的前半部分４６８ｂｐ的碱基序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘长军，张艳萍，李志杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93
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