本发明专利技术公开了一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法。该方法采用ＰＣＲ技术：对马立克氏病病毒血清１型疫苗株ＣＶＩ９８８、８１４、ＣＶＩ９８８回归鸡体内一代分离株ＣＶＩ９８８／ＢＰ１和特超强毒株６４８Ａ、超强毒株Ｇ２、Ｎ以及强毒株ＹＬ０４０９２０、ＧＸＹ１、ＧＸＹ２、ＧＸＹＬ１、ＧＸ０７００６０、ＧＸ０７００７９、ＧＸ０７００９２、ＧＸ０８００３６、ＧＸ０８００５１、ＧＸ０８００５９等１６个毒株进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ产物进行核苷酸序列的测定得到了确认。本发明专利技术所建立的方法可以对国内外广泛使用疫苗株ＣＶ１９８８以及８１４的养殖场进行肿瘤病毒检测与疾病诊断以及实验研究这些病毒株的相互鉴别。它对鸡群早期感染强毒、疾病的流行病学以及临床肿瘤病的确切诊断、环境病毒的检测和马立克氏病的预防与控制均具有十分重要的意义及应用价值。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
一种区分马立克氏病病毒疫苗毒株与强毒株的鉴别方法，其特征在于，采用ＰＣＲ技术：对马立克氏病病毒血清１型疫苗株ＣＶＩ９８８、８１４、ＣＶＩ９８８回归鸡体内一代分离株ＣＶＩ９８８／ＢＰ１和特超强毒株６４８Ａ、超强毒株Ｇ２、Ｎ以及强毒株ＹＬ０４０９２０、ＧＸＹ１、ＧＸＹ２、ＧＸＹＬ１、ＧＸ０７００６０、ＧＸ０７００７９、ＧＸ０７００９２、ＧＸ０８００３６、ＧＸ０８００５１、ＧＸ０８００５９等１６个毒株进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ产物进行核苷酸序列的测定得到了确认，具体操作步骤如下：，按下列试剂用量在１６个ＰＣＲ反应管中分别加入各成分：１０×Ｂｕｆｆｅｒ ５．０μＬ，１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２．０μＬ，上、下游引物各１．０μＬ，５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，各个反应管分别加入２．０μＬ的６４８Ａ、Ｇ２、Ｎ株的基因组ＤＮＡ和步骤２）各样品模板ＤＮＡ，用灭菌双蒸水补足至总体积为５０μＬ； ４）ＰＣＲ反应条件 将ＰＣＲ反应管置于ＰＣＲ扩增仪中进行循环，反应循环参数：９５℃预变性３ｍｉｎ；３０个循环：９４℃变性３０ｓｅｃ、６０℃退火３０ｓｅｃ、７２℃延伸１ｍｉｎ；７２℃延伸５ｍｉｎ，得到ＰＣＲ产物； ５）ＰＣＲ产物的检测 取８μＬ ＰＣＲ反应产物与１μＬ重量浓度１０％溴酚蓝染料混合，放入含溴化乙锭０．５μｇ／ｍＬ重量浓度为１％琼脂糖凝胶孔中，在８０Ｖ电压的条件下电泳１小时后，在紫外透射仪下观察ＰＣＲ产物，检查ＰＣＲ产物的预期大小，在凝胶成像系统下拍照、并记录试验结果； ６）结果与判定 在紫外灯下观察并于标准分子量相对照，所有毒株都只扩增出一条带，ＣＶ１９８８、８１４、ＣＶＩ９８８／ＢＰ１、６４８Ａ、Ｇ２、Ｎ、ＹＬ０４０９２０、ＧＸＹ１、ＧＸＹ２、ＧＸＹＬ１、ＧＸ０７００６０、ＧＸ０７００７９、ＧＸ０７００９２、ＧＸ０８００３６、ＧＸ０８００５１、ＧＸ０８００５９出现的片段分别是７３８ｂｐ、７３５ｂｐ、７３８ｂｐ、８１８ｂｐ、９５２ｂｐ、９５１ｂｐ、９６８ｂｐ、９７２ｂｐ、９７４ｂｐ、９６８ｂｐ、９７０ｂｐ、９６６ｂｐ、９７０ｂｐ、１１８７ｂｐ、１１８５ｂｐ、１１８８ｂｐ。 ７）ＰＣＲ产物的纯化 在紫外灯下切下步骤６）判定的片段，用ＳＩＧＥＭＡ凝胶回收试剂盒进行回收； ８）ＰＣＲ产物的克隆 将ＰＣＲ产物与载体ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ进行连接，按常规方法将转化产物分别转化感受态细胞，挑取白色单个菌落...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韦平，滕丽琼，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]
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