本发明专利技术公开了肿大细胞病毒ｖｓｏｃｓ基因缺失减毒活疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术减毒活疫苗是利用基因工程原理将绿色荧光蛋白ＧＦＰ报告基因替代肿大细胞病毒ｖｓｏｃｓ基因，构建重组转移载体，同源重组后，经分离、纯化，获得重组ｖｓｏｃｓ基因缺失的肿大细胞病毒，将其作为肿大细胞病毒基因工程疫苗。本发明专利技术减毒活疫苗具有免疫力强、用量少、成本低、可联合使用、同时启动细胞免疫和体液免疫、保护时间长、不需添加佐剂的优点，通过水体浸泡感染即可使宿主鱼体产生免疫，不仅弥补了传统肿大细胞病毒灭活疫苗、弱毒疫苗或基因工程亚单位疫苗的不足，还有利于大规模推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种肿大细胞病毒KSO^基因缺失减毒活疫 苗及其制备方法和应用。
技术介绍
我国是世界海水养殖产业大国，养殖规模和产量居世界第一。但是，随着养殖品种 的增多和养殖规模的扩大，各种养殖品种每年发病率均在50%以上，而死亡率高达20%以 上，直接造成的经济损失每年超过百亿元人民币。病害已经成为水产养殖可持续发展的主 要障碍。肿大细胞病毒是新近出现的对鱼类具有重大危害作用的恶性传染病的病原，分 子流行病学研究发现，有50多种的海水鱼类和近10种的淡水鱼类是这种病毒的携带者。 肿大细胞病毒对世界各国，特别是东亚、东南亚及澳大利亚等国家和地区的水产养殖业构 成巨大威胁，每年都能造成重大经济损失。目前，肿大细胞病毒的主要毒株有流行于于中 国大陆的鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、斜带石斑鱼虹彩病毒(0SGIV)、大黄鱼虹彩病毒 (LYCIV)、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)、斑石鲷虹彩病毒(SKIV)；流行于日本的真鲷虹彩 病毒(RSIV)、石斑鱼昏睡病虹彩病毒(GSDIV)、非洲灯笼鱼虹彩病毒(ALIV)和闪电丽鱼虹 彩病毒(DGIV)；流行于韩国的条石鲷虹彩病毒(RBIV)、牙鲆虹彩病毒(FLIV)、大菱鲆虹彩 病毒(TBIV)；流行于中国台湾的真鲷虹彩病毒和台湾石斑鱼虹彩病毒(TGIV)；出现在新加 坡的鲻鱼和虎斑虹彩病毒及流行于澳大利亚的巨鳕银鲈虹彩病毒(MCIV)和丽丽鱼虹彩病 毒(DGIV)等。肿大细胞病毒的宿主覆盖了众多具有重大经济价值的养殖鱼类，对肿大细胞 病毒所引发的系列鱼病的控制成为有关国家的共识。开展免疫防治是控制肿大细胞病毒流行和危害的有效手段。国际上，日本借助 RSIV的高敏感细胞系GF (石鲈鳍条细胞系)研制的RSIV全细胞灭活疫苗成功实现了商业 化生产，已经比较广泛地应用于真鲷等海水养殖鱼类。RSIV灭活苗也曾经出口到我国广 东及海南等沿海养殖区，在一些名贵海水养殖鱼类(石斑鱼，真鲷)中有所应用，总体效果不 错。但由于价格偏贵(注射免疫，约1元/尾)，注射免疫耗时耗力等不利因素的影响，日本 进口的RSIV灭活苗在我国的应用比较有限。此外，由于灭活疫苗存在免疫期短、保护力低、 用量大以及通常需要加入佐剂，并缺乏自然感染的局部免疫保护的因素限制了该类疫苗的 发展。因此，开发新型的渔用基因工程疫苗成为当前水产病害控制的首要问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种肿大细胞病毒基因缺失活疫苗， 该疫苗可以通过水体浸泡的方法用于鱼类肿大细胞病毒的预防，大大降低水产业病毒性疾 病的发病率和操作成本。本专利技术的另一个目的是提供上述肿大细胞病毒疫苗的制备方法，该制备方法简单，成本低，有利于大规模推广应用。本专利技术的另一个目的是提供上述肿大细胞病毒疫苗在鱼类肿大细胞病毒预防中 的应用。本专利技术的上述目的通过以下方案予以实现一种肿大细胞病毒KSO^基因缺失减毒活疫苗，该疫苗是通过在鱼类细胞中通过基因 工程技术将外源GFP基因替代肿大细胞病毒的KS0^基因而得到的重组KS0C1S基因缺失病 毒，收获病毒液并稀释后得到的。上述肿大细胞病毒减毒活疫苗的制备方法，其具体步骤如下(1)重组KSOC1S基因缺失病毒转移载体的构建(图1):通过PCR扩增KSOC1S基因在ISKNV 基因组上下游各约IOOObp的DNA片段，分别插入同一个克隆载体pUC18中；通过双酶切真 核表达载体PEGFP-C3，获得含CMV启动子的绿色荧光蛋白GFP真核表达框，插入上述pUC18 载体的KSO^基因上下游片段之间，该克隆载体为KSO^基因缺失病毒转移载体；(2)细胞的制备将鱼类细胞系经酶消化分散后，进行细胞培养成片，用于接种肿大细 胞病毒；(3)重组vsocs基因缺失病毒的接种和培养上述鱼类细胞培养成片后，吸出培养瓶中 的培养基，然后加入重组vsocs基因缺失病毒液，进行病毒吸附；病毒吸附结束后，吸出感 染上清，加入细胞维持液，再次进行细胞培养，至细胞出现明显病变为止；(4)重组KSO^基因缺失病毒液的收集、稀释和保存将上述病变的细胞经三次冻融 后，收获病毒液，经0. 22 μ m滤器过滤后，稀释于PBS溶液中，分装并保存于-80°C冰箱中，即 得肿大病毒KSO^基因缺失减毒活疫苗成品；(5)减毒活疫苗的使用将上述重组KSOC1S基因缺失病毒液以1:2，000-1100, 000的 不同浓度稀释于水体中，即可通过浸泡感染的途径对鱼体进行免疫。上述步骤(1)中，病毒缺失基因为vsocs基因(如ISKNV 0RF103及其同源基因)。上述步骤(2)中，消化时可用胰酶，细胞培养成片时可采用DMEM完全培养液中 27°C培养。上述步骤(3)中，病毒吸附可以选择在27°C的温度下吸附1小时，细胞维持液可选 择采用添加有10%FBS的DMEM。本专利技术的FBS (胎牛血清)和DMEM均为本领域通用试剂，市佳口。上述步骤(4)中，用于稀释病毒灭活液的盐类缓冲液可以选择无菌磷酸盐缓冲液， 稀释倍数为10倍。上述步骤(5)中，稀释后的病毒液与浸泡水体的体积比为1 2，000-1 100，000。鱼体浸泡免疫时间为2、h，带浸泡免疫后的鱼体即可放回养殖池。本专利技术的肿大细胞病毒疫苗可用于预防海鱼类、淡水鱼类的肿大细胞病毒感染。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果1.本专利技术的肿大细胞病毒疫苗对鱼类预防肿大细胞病毒感染的保护作用可达80%；2.本专利技术的疫苗本身不含对人类有害的成分，对注射疫苗的鱼类可以安全食用；3.疫苗本身对鱼类生长没有影响，在保证水环境和饲料的情况下，被注射有疫苗的鱼 类生长状况良好；4.避免了传统减毒疫苗的返祖而重新获得毒力；5.免疫力持续时间长达半年以上；6.可通过水体浸泡免疫，操作简单、节省各种人工费用；7.本专利技术的疫苗制备方法简单，所用试剂成本低，有利于大规模推广；8.本专利技术的疫苗本身不易失效，普通冰箱4°C放置一周仍有效。附图说明图1为重组vSOCS基因的转移载体构建流程；图2为减毒活疫苗组、阴性对照组和病毒组三组鱼在免疫期间的死亡情况。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步具体说明。应理解，这些实施例仅用于说 明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1 肿大细胞病毒重组转移载体的构建本实施例的选取ISKNV基因作为研究对象，利用病毒在细胞内复制过程中的同源重组原理，将外源GFP基因替代KSOC1S基因，从而获得重组KSOC1S基因缺失的ISKNV。本实施例肿大细胞病毒重组转移载体的构建，包括如下步骤(1)通过PCR扩增KSOC1S基因在ISKNV基因组上下游各约IOOObp的DNA片段，分别插 入同一个克隆载体PUC18中；(2)通过双酶切真核表达载体PEGFP-C3，获得含CMV启动子的绿色荧光蛋白GFP真核 表达框，插入上述PUC18载体的MOM基因上下游片段之间，该克隆载体为MOM基因缺失 病毒转移载体。实施例2肿大细胞病毒减毒活疫苗的制备本实施例的生物材料选择鳜鱼，病毒选择重组vsocs基因缺失ISKNV病毒。本实施例肿大细胞病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤(1)细胞的制备将鳜仔鱼细胞系(MMF-1)用胰酶消化分散，加入DMEM完全培养液在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿大细胞病毒ｖｓｏｃｓ基因缺失减毒活疫苗，其特征在于该疫苗是利用基因工程原理将绿色荧光蛋白ＧＦＰ报告基因替代肿大细胞病毒ｖｓｏｃｓ基因，构建并分离、纯化获得重组ｖｓｏｃｓ基因缺失病毒，将其作为肿大细胞病毒减毒活疫苗，该减毒活疫苗通过水体浸泡感染而使宿主鱼体产生免疫。
【技术特征摘要】
一种肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗，其特征在于该疫苗是利用基因工程原理将绿色荧光蛋白GFP报告基因替代肿大细胞病毒vsocs基因，构建并分离、纯化获得重组vsocs基因缺失病毒，将其作为肿大细胞病毒减毒活疫苗，该减毒活疫苗通过水体浸泡感染而使宿主鱼体产生免疫。2.权利要求1所述肿大细胞病毒KSOM基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于 该制备方法包括如下步骤(1)重组KSOC1S基因缺失病毒转移载体的构建通过PCR扩增KSOC1S基因在ISKNV基 因组上下游各约IOOObp的DNA片段，分别插入同一个克隆载体pUC18中；通过双酶切真核 表达载体PEGFP-C3，获得含CMV启动子的绿色荧光蛋白GFP真核表达框，插入上述pUC18载 体的KSO^基因上下游片段之间，该克隆载体为KSO^基因缺失病毒转移载体；(2)重组Ksoa基因缺失病毒的同源重组鳜鱼仔鱼细胞先通过瞬时转染Ksoa基因 缺失病毒转移载体5h后，再感染病毒lh，根据病毒复制的同源重组原理，72-96h预期获得 GFP基因替代KSOC1S基因的重组KSOC1S基因缺失病毒；(3)重组KSO^基因缺失病毒的分离和纯化通过荧光显微镜观察并挑取发生病变且 表达GFP蛋白的细胞，通过有限稀释法获得单克隆化的重组KSO^基因缺失病毒；(4)肿大细胞病毒基因缺失减毒活疫苗的制备上述单克隆化的重组KS0^基因缺 失病毒，通过感染MFF-I细胞，扩大培养；将病变的细胞经三次冻融后，收获病毒液，经 0. 22 μ m滤器过滤后，稀释于PBS溶液中，分装并保存于-80°C冰箱中，即得肿大病毒ksom 基因缺失减毒活疫苗成品；(5)水体浸泡感染体系以不同稀释度的重组KSO^基因缺失病毒，通过水体浸泡感染 鳜鱼2、h，记录感...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭长军，何建国，黄志坚，张颖芬，翁少萍，杨丽诗，阳晓波，刘东，贾坤同，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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