马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法技术

本发明专利技术公开了马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法。采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术，对ＭＤＶ－１攻毒的９９羽霞烟鸡ＢＬＢ２基因第２外显子进行ＰＣＲ扩增，并对其ＰＣＲ产物进行Ａｌｕ?Ｉ、Ｃａｉ?Ｉ、Ｃｆｒ?Ｉ、Ｈｉｎ１?Ｉ、Ｈｉｎｆ?Ｉ和Ｒｓａ?Ｉ限制性内切酶酶切分析，对这６个位点酶切分析初步获得ＢＬＢ２等位基因纯合型鸡只７羽；通过对这７羽纯合鸡ＢＬＢ２与ＢＦ２基因测序，最终获得ＢＬＢ２／ＢＦ２等位基因纯合型鸡只６羽；结合攻毒结果，认定其中ＭＤ抗性个体４羽。本发明专利技术建立的方法能检测到ＭＤ抗性纯合基因型鸡，并以其为种鸡来繁殖ＭＤ抗性鸡，这对从遗传素质上做好ＭＤ及相关免疫抑制性疾病的预防和控制具有极其可观的经济效益。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
马立克氏病抗性纯合基因型鸡的检测方法，其特征在于，采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术，对ＭＤＶ－１攻毒后的９９羽霞烟鸡ＢＬＢ２基因第２外显子进行ＰＣＲ扩增，并对其ＰＣＲ产物进行ＡｌｕＩ、ＣａｉＩ、ＣｆｒＩ、Ｈｉｎ１Ｉ、ＨｉｎｆＩ和ＲｓａＩ限制性内切酶酶切分析，利用对这６个位点酶切分析初步获得ＢＬＢ２等位基因纯合型鸡只７羽；建立扩增ＢＦ２基因的ＰＣＲ方法，并通过对获得的７羽纯合鸡ＢＬＢ２与ＢＦ２基因测序，最终获得ＢＬＢ２／ＢＦ２等位基因纯合型鸡只６羽；结合攻毒结果，认定其中ＭＤ抗性个体４只有大小为３１７ｂｐ片断时，可确认ＭＤＶ－１单一感染；　　４）霞烟鸡ＢＬＢ２基因的ＰＣＲ扩增　　合成用于扩增ＢＬＢ２基因第２外显子的引物：上游引物为５’ＣＡＧＣＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴ３’，下游引物为５’ＴＣＡＣＣＴＴＧＧＧＣＴＣＣＡＣＴＧＣＧ３’，扩增片段应为３７４ｂｐ；ＰＣＲ反应体系：１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ５μＬ、８０％甘油４μＬ、二甲基亚砜２μＬ、１０ｍＭｄＮＴＰ１μＬ、２５ｐＭ上、下游引物各１μＬ、Ｔａｑ酶１．５Ｕ、ＤＮＡ模板５μＬ，灭菌三蒸水补足５０μＬ；反应循环参数：９５℃预变性１ｍｉｎ，３５个循环：９４℃变性３０ｓ、５３℃退火３０ｓ、７２℃延伸３０ｓ，７２℃后延伸８ｍｉｎ；产物用２．０％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照，结果应只有大小为３７４ｂｐ片断一条；　　５）ＰＣＲ产物的酶切分析　　ＰＣＲ产物分别用限制性内切酶ＡｌｕＩ、ＣａｉＩ、ＣｆｒＩ、Ｈｉｎ１Ｉ、ＨｉｎｆＩ和ＲｓａＩ进行酶切处理；反应体系：１０×ｂｕｆｆｅｒ１μＬ，ＰＣＲ产物５μＬ，限制性内切酶均为５Ｕ，双蒸水补足１０μＬ，将样品混匀后离心，３７℃水浴消化过夜，用２．５％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，分析酶切结果并利用表３得到纯合基因型组合的鸡；　　６）ＢＬＢ２等位基因纯合型鸡只的确定　　对在这６个酶切位点所观测的纯合基因型组合的鸡只进行ＢＬＢ２基因的克隆、序列测定，用２％的琼脂糖凝胶分离ＰＣＲ产物，将目的带切下后用ＤＮＡ纯化回收试剂盒纯化回收；除对ＰＣＲ产物进行直接测序外，并将同一个样品的２次独立扩增、纯化产物与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接后转化到大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，提取质粒作为测序模板，每一个克隆最少挑取５个克隆子分别测序；　　７）ＢＬＢ２基因序列同源性检索鉴定与比较分析　　通过美国国家生物技术信息中心网站的ＢＬＡＳＴ软件，将测序后获得的ＤＮＡ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韦平，金元昌，韦信贤，赵子轶，李娅，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]