一种凝血基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术提供了一种凝血基因组DNA的提取方法，提取前在样品中加入纳豆激酶，利用纳豆激酶具有血栓溶解剂UK的数倍以上的血栓溶解力，可以迅速的分解血纤维蛋白，进而分离血凝块使之成为均一的溶液，去除因凝血块造成血液DNA提取的障碍，从而显著提高血液DNA的提取速度，同时大大增加DNA产物的纯度和产量。本发明专利技术方法适用于从犯罪现场或死亡尸体采集凝血块提取DNA、高通量血液gDNA提取以及抗体分析实验中血液gDNA的提取。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因组DNA的提取方法，具体涉及一种从人凝血块中提取基因组DNA 的方法。
技术介绍
血液提取DNA可广泛用于疾病诊断、遗传基因分析、身份识别等。医学正在从传统的医学治疗往分子生物检验诊断辅助治疗迅速发展。在血液DNA提取过程中，尤其是进行高通量血液DNA提取过程中，由于种种原因，经常会发生个别样品血液产生凝血块。此外， 犯罪现场的残留血样由于保存过久也会产生大量的凝血块。产生的凝血块将会阻碍高通量的血液提取的顺利进行。现在普遍的血液DNA提取需要采用机械研磨方法研磨凝血块，然后提取血液DNA，这样耗时、操作不便和无法完全去除残留因血纤维蛋白而产生的凝血块， 实验结果也大打折扣。传统的凝血块处理方式主要有以下两种1)研磨法离心过滤法将凝血块研磨成尽量均一的溶液，但由于凝血块中的纤维蛋白异常顽固，非常难研磨，且研磨会造成血液 DNA的大量降解，造成DNA片段长度大大降低。2)去垢剂法采用去垢剂Triton χ-100，尽量去除红细胞及一些蛋白杂质，再用强行化学裂解液过夜溶解凝血块，但由于凝血酶作用于血纤维蛋白原形成的血纤维蛋白是无法用一般的化学方法溶解的，因此，这一方法也造成DNA得率和纯度均不理想。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种凝血基因组DNA的提取方法，以解决含有凝血块的全血在提取基因组DNA时，DNA得率和纯度均不理想的难题。本专利技术所解决的技术问题通过以下技术方案来实现一种凝血基因组DNA的提取方法，包括以下步骤1)往血凝块中加入纳豆激酶至终浓度为40-80mg/ml，室温放置5min待凝血块消失，加入1/10倍样品体积的蛋白酶K，然后加入1倍样品体积的裂解缓冲液(裂解液配方 20% SDS, 1% Triton-xlOO, IOOmM 醋酸钠，50mM EDTA, PH5. 2)，振荡混勻；2) 65°C下温浴lOmin，期间振荡混勻一次，然后加入1. 04倍样品体积的无水乙醇， 振荡混勻；3)将DNA吸附柱插入收集管中，将样品液加入吸附柱中，12，OOOrpm离心30S，倒掉废液；4)向吸附柱中加入2倍样品体积的洗涤缓冲液，12，OOOrpm离心30秒(洗涤缓冲液配方8M盐酸胍乙醇=13 17)5)将DNA吸附柱重新插入收集管中，向DNA吸附柱中加入2倍样品体积的70%乙醇，12，OOOrpm离心30S,重复以上步骤1次；6) 12，OOOrpm离心Imin JfDNA吸附柱插入离心管中，向吸附柱中加入0. 4-0. 6倍样品体积预热的洗脱液，室温静置anin ；7) 13，OOOrpm 离心 Imin 洗脱 DNA，洗脱得到 60-70% DNA。优选地，在所述1)步骤中加入0. 02倍样品体积的RNase A。优选地，所述1)步骤中加入纳豆激酶至终浓度为60mg/ml。优选地，所述5)步骤中离心选择开盖离心。优选地，所述6)步骤中预热的洗脱液温度为65°C。优选地，在所述6)步骤结束后，再次用0.4倍样品体积预热的洗脱液再次洗脱 DNA，洗脱收获另外20%的DNA。本专利技术的有益效果是本专利技术采用在样品中加入纳豆激酶的方法，由于纳豆激酶具有血栓溶解剂M数倍以上的血栓溶解力，利用其酶活性可以迅速地分解血纤维蛋白，进而分离凝血块，使凝血块成为均一的溶液，去除因凝血块造成血液DNA提取的障碍，从而显著提高血液DNA的提取速度，同事大大增加DNA产物的纯度和产量。本专利技术方法适用于以下情况1)犯罪现场采集凝血块犯罪现场采集凝血块时，由于血液量小且都已经凝结成小块，采用本专利技术方法可以最大限度的利用凝血块提取DNA，充分利用宝贵的材料；2)高通量血液gDNA提取由于高通量血液gDNA提取过程中一般会伴随有少量的凝血块出现，可能造成DNA实验中断，或导致最终纯化产物纯度过低或是得率大大下降，采用本专利技术方法进行处理可以很好的去除血液中残留的凝血块，保证实验顺利进行；3)从死亡尸体采凝固血由于死亡尸体的血液已经凝固，采集其身上的凝固血后，采用本专利技术方法处理可以顺利提出血液gDNA ；4)抗体分析实验中血液gDNA提取很多抗体提取实验的血液中不加入抗凝剂，然后取血液上清制备抗体，造成血液凝固，很难进行基因组DNA的提取，用本专利技术方法可以很好解决这一问题。附图说明图1为采用本专利技术方法提取血液gDNA的跑胶图；1、样品一为新鲜的凝血块(有血清)兔血；2、样品二为新鲜的凝血块(无血清) 兔血；3、样品三为-20°C保存一个月的人凝血块；4、样品四为-20°C保存一个星期的人凝血块，加样均为5ul。图2为采用机械研磨法提取血液gDNA的跑胶图。样品1和样品2为不同采集方式的新鲜血液，其中样品1采用容器盛装，但没有加抗凝剂；样品2为没有用容器盛装，为凝血块；样品3和样品4为不同保存时间的凝血块，其中样品3为保存一个月的凝血块， 样品4为保存一个星期的凝血块。具体实施例方式为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明的了解，下面结合具体图示，进一步阐述本专利技术。实施例1 材料来源纳豆激酶，40000Fu/g，上海崴达公司购买；蛋白酶K采用sigma蛋白酶 K0样品来源样品一新鲜的凝血块(有血清)兔血；样品二 新鲜的凝血块(无血清)兔血；样品三-20°C保存一个月的人凝血块；样品四-20°C保存一个星期的人凝血块。样品采集量均为250 μ L，进行如下处理1、将样品转移至1.5mL离心管，若样品量不足250ul，加入PBS或TE Buffer补至250 μ L，加入纳豆激酶20mg，室温放置5min待凝块消失；在离心管中加入25 μ L蛋白酶K和250 μ L裂解液，振荡10秒混勻，加入5 μ L RNase A ；(裂解液配方20% SDS, 1 % Triton-xlOO, IOOmM 醋酸钠，50mM EDTA, PH5. 2)2、65°C温浴10分钟，期间振荡混勻一次；向裂解液中加入260 μ L无水乙醇，振荡混勻，瞬时离心收集管盖上的液体；3、将一个DNA吸附柱插入2mL收集管，将样品液加入吸附柱中，12，OOOrpm离心30秒，倒掉废液；4、向吸附柱中加入500 μ L洗涤缓冲液，12，OOOrpm离心30秒(洗涤缓冲液配方 8Μ盐酸胍乙醇=13 17)5、向吸附柱中加入500 μ L 70%乙醇，12，OOOrpm离心30秒，弃收集管与废液，重复该步骤1次；6、12，OOOrpm打开盖离心1分钟，将DNA吸附柱插入一个新的1. 5ml离心管，向吸附柱中加入100-150 μ L预热(65°C )洗脱液，室温静置2_5分钟(或是65°C温浴3分钟可以大大提高得率及去除残留乙醇)7、彡13，OOOrpm离心1分钟洗脱DNA，第一次洗脱通常能得到60-70 % DNA，用 IOOul预热(65°C )洗脱液再次洗脱DNA，第2次洗脱可收获另外20%的DNA。上述提取时间约为半个小时，加上检测的半个小时，一共在一个小时内全部完成。提取DNA跑胶结果见附图1 ；采用常规机械研磨法提取血液gDNA的跑胶结果见附图2。结果，图1中DNA条带清晰无拖尾现象，而图2中DNA条带不集中且有明显的拖尾现象，说明采用本专利技术方法提取的DNA纯度更高。上述四种样品采用本专利技术方法提取的DNA实验数本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种凝血基因组ＤＮＡ的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：１）往血凝块中加入纳豆激酶至终浓度为４０－８０ｍｇ／ｍｌ，室温放置５ｍｉｎ待凝血块消失，加入１／１０倍样品体积的蛋白酶Ｋ，然后加入１倍样品体积的裂解液缓冲液，振荡混匀；２）６５℃下温浴１０ｍｉｎ，期间振荡混匀一次，然后加入１．０４倍样品体积的无水乙醇，振荡混匀；３）将ＤＮＡ吸附柱插入收集管中，将样品液加入吸附柱中，１２，０００ｒｐｍ离心３０Ｓ，倒掉废液；４）向吸附柱中加入２倍样品体积的洗涤缓冲液，１２，０００ｒｐｍ离心３０秒（洗涤缓冲液配方：８Ｍ盐酸胍∶乙醇＝１３∶１７）５）将ＤＮＡ吸附柱重新插入收集管中，向ＤＮＡ吸附柱中加入２倍样品体积的７０％乙醇，１２，０００ｒｐｍ离心３０Ｓ，重复以上步骤１次；６）１２，０００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，将ＤＮＡ吸附柱插入离心管中，向吸附柱中加入０．４－０．６倍样品体积预热的洗脱液，室温静置２ｍｉｎ；７）１３，０００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ洗脱ＤＮＡ，洗脱得到６０－７０％ＤＮＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴剑，匡虹桥，
申请(专利权)人：吴剑，匡虹桥，
类型：发明
国别省市：43