腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法以及DC-CIK的应用。该腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法包括的步骤有：腹水肿瘤抗原的制备；脐带血单个核细胞的制备；脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离；CIK细胞的诱导扩增；DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原；DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK。本发明专利技术腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法制备的DC-CIK增殖活性和杀瘤活性高，其该方法工序简单，条件易控，对设备要求低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体的涉及一种腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法与DC-CIK的应用。
技术介绍
免疫治疗是即手术、放疗和化疗之外肿瘤临床治疗的重要手段，对清除肿瘤患者体内残留和转移的肿瘤细胞，防止肿瘤的转移和复发及提高患者的生存率和生存治疗具有重要的作用和价值。目前肿瘤的免疫治疗手段主要有淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、经修饰的自体树突状细胞刺激的T淋巴细胞治疗(DC-T)、自体树突细胞刺激的CIK免疫治疗(DC-CIK)等。DC细胞是Meinman和Cohn于1973年首先报道的，因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名。它是目前发现的功能最强的专职抗原呈递细胞(APC)，DC在免疫应答过程中处于调控地位①机体的卫士 未成熟的DC主要在分布的原位摄取、加工和处理抗原，然后迁移至淋巴器官激发免疫应答。②免疫应答的始动者成熟的DC递呈抗原并刺激静息期的初始型和记忆性T细胞，使其活化。③有刺激T细胞的强效数量很少的DC和低水平的抗原就能诱导强烈的T细胞应答，表达协同刺激分子。有研究显示，绝大多数肿瘤患者存在 DC数量减少和功能障碍，DC的浸润程度与淋巴结转移、肿瘤的浸润深度、转移复发、预后等均有密切的关系，同时也提示体外诱导足够数量的功能强大的DC用于纠正患者的免疫缺陷成为一种可能。CIK细胞是一种非主要组织相容性复合体(MHC)限制性的细胞毒性T淋巴细胞。 CIK用于杀伤肿瘤被认为是肿瘤过继免疫治疗的首选方案。树突状细胞(DC)在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起到桥梁和枢纽作用。二者共同培养后，不仅提高了 CIK的增殖能力和杀伤活性，并且治疗范围广泛，对多个系统的肿瘤具有1+1 > 2的疗效。目前DC-CIK主要是无抗原致敏的DC-CIK、肿瘤特异性抗原致敏的DC-CIK及肿瘤细胞株致敏的DC-CIK。大量研究表明，DC与CIK细胞共同培养后，DC的抗原提呈及激发机体免疫应答的能力得到提高，CIK的增殖活性和细胞毒作用得以增强。经抗原负载的DC与未经抗原负载的DC均可使CIK细胞的杀瘤活性提高，但是经抗原负载的DC能够提成更多的肿瘤抗原，更好地协同刺激CIK细胞的活化，具有更高的杀瘤活性，两者比较有显著差异 (P < 0. 05)。DC细胞体外负载的抗原主要是已知的肿瘤特异性抗原，肿瘤细胞株裂解物。由于很多肿瘤的特异性抗原尚未明确并且肿瘤发生的抗原突变能抵抗单一抗原的免疫攻击，因此用特异性抗原致敏DC细胞具有一定的局限性。另外肿瘤细胞株在体外传代过程中表面抗原可能发生改变，DC细胞不能将该肿瘤的所有抗原呈递给效应T细胞，限制了 DC-CIK的体内抗肿瘤效应。传统的腹水肿瘤细胞的提取方法有多种，免疫磁珠法较为先进，但是需要特异性肿瘤细胞抗体，价格昂贵；密度梯度离心法操作较为简单、经济，但是由于腹水中含有较多的红细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等，制备成的细胞悬液密度较高，不利于肿瘤细胞的分离；贴壁培养法，将淋巴细胞分离液分离得到的淋巴细胞与肿瘤细胞混合物共同培养，根据肿瘤细胞易贴壁而淋巴细胞不贴壁的原理分离肿瘤细胞，细胞需要在体外传代培养，表面抗原亦可能发生变化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能获得高增殖活性和杀瘤活性的腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下一种腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法，包括如下步骤腹水肿瘤抗原的制备用PBS缓冲液重悬腹水肿瘤细胞，再与终浓度为0. 1 1. Omg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂混合，形成混合液，置于液氮中5 IOmin后，接着置入36 38°C水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反复2 5次，然后依次进行离心，微孔滤膜过滤，得到腹水肿瘤抗原；脐带血单个核细胞的制备将获取的新鲜脐带血离心后，分别收集上层的脐带血浆和下层的脐带血细胞，将所述脐带血细胞用DPBS缓冲液稀释，再用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用DPBS缓冲液清洗，显微镜下观察计单个核细胞数，最后用淋巴细胞培养液 GT-T551调节单个核细胞密度为1 2X IO6个/ml，得到单个核细胞悬液，其中，所述淋巴细胞培养液GT-T551含有体积浓度为1 10%所述脐带血浆；脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离将所述单个核细胞悬液培养1 1. 5小时，然后冲洗细胞，获得没有粘附的细胞和粘附细胞；CIK细胞的诱导扩增将所述没有粘附的细胞移入含体积浓度1 10%的所述脐带血浆的淋巴细胞培养液GT-T551中，并加入终浓度为500 1000IU/ml的重组人γ-干扰素混合，再培养12 36小时后，加入终浓度为50ng/ml 250ng/ml抗胸腺细胞球蛋白、 终浓度为0. 5 2ng/ml的重组人白细胞介素_1、终浓度为500 1000IU/ml的重组人白细胞介素-2进行再次培养7 8天，收集CIK细胞；DC细胞的诱导扩增及DC细胞负载腹水肿瘤抗原将所述粘附细胞加入DC培养液中培养2 4天后加入终浓度为15 30 μ g/ml的所述腹水肿瘤抗原继续培养2 4天后， 加入终浓度为200 lOOOng/ml的肿瘤坏死因子，得到负载肿瘤抗原的DC细胞；DC细胞与CIK细胞共培养制备DC-CIK 将所述负载肿瘤抗原的DC细胞与所述CIK 细胞混合培养，得到腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK。上述腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法制备的DC-CIK增殖活性和杀瘤活性高，其增殖倍数平均高达210. 33士 1. 16，是传统方法获得的DC-CIK增殖倍数的2倍，具体数值参见表1 ；其杀瘤率高达70 80%，与传统方法获得的DC-CIK杀瘤率相比，提高了 10 30%。其中，上述腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法采用腹水肿瘤细胞获取腹水肿瘤细胞抗原，与肿瘤特异性抗原相比，该腹水肿瘤细胞抗原中抗原肽丰富，有效避免了肿瘤细胞可能对特异性单一抗原的抵抗作用；与肿瘤细胞株抗原相比，由于腹水肿瘤细胞是原代细胞，可以避免肿瘤细胞株在体外传代过程中可能产生的抗原结构的改变；在腹水肿瘤抗原制备的步骤中，蛋白酶抑制剂有效保持了肿瘤抗原的完整性；在CIK细胞诱导扩增步骤中的抗胸腺细胞球蛋白提高了 DC-CIK的增殖效率。另外，上述腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法工序简单，条件易控，对设备要求低。由于该方法获得的DC-CIK增殖效率高，因此， 有效降低了获取DC-CIK的成本。附图说明图1是本专利技术实施例腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法工艺流程示意图。 具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种能获得高增殖活性和杀瘤活性的腹水肿瘤细胞致敏 DC-CIK的制备方法。该腹水肿瘤细胞致敏DC-CIK的制备方法的工艺流程如图1所示，包括如下步骤步骤Si，腹水肿瘤抗原的制备用PBS缓冲液重悬腹水肿瘤细胞，再与终浓度为 0. 1 1. Omg/ml的亮抑蛋白酶抑制剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种腹水肿瘤细胞致敏ＤＣ－ＣＩＫ的制备方法，包括如下步骤：腹水肿瘤抗原的制备：用ＰＢＳ缓冲液重悬腹水肿瘤细胞，再与终浓度为０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ的亮抑蛋白酶抑制剂混合，形成混合液，置于液氮中５～１０ｍｉｎ后，接着置入３６～３８℃水浴中，待混合液完全融化后，再次放入液氮中，反复２～５次，然后依次进行离心，微孔滤膜过滤，得到腹水肿瘤抗原；脐带血单个核细胞的制备：将获取的新鲜脐带血离心后，分别收集上层的脐带血浆和下层的脐带血细胞，将所述脐带血细胞用ＤＰＢＳ缓冲液稀释，再用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用ＤＰＢＳ缓冲液清洗，显微镜下观察计单个核细胞数，最后用淋巴细胞培养液ＧＴ－Ｔ５５１调节单个核细胞密度为１～２×１０６个／ｍｌ，得到单个核细胞悬液，其中，所述淋巴细胞培养液ＧＴ－Ｔ５５１含有体积浓度为１～１０％所述脐带血浆；脐带血淋巴细胞和粘附细胞的分离：将所述单个核细胞悬液培养１～１．５小时，然后冲洗细胞，获得没有粘附的细胞和粘附细胞；ＣＩＫ细胞的诱导扩增：将所述没有粘附的细胞移入含体积浓度１～１０％的所述脐带血浆的淋巴细胞培养液ＧＴ－Ｔ５５１中，并加入终浓度为５００～１０００ＩＵ／ｍｌ的重组人γ－干扰素混合，再培养１２～３６小时后，加入终浓度为５０ｎｇ／ｍｌ～２５０ｎｇ／ｍｌ抗胸腺细胞球蛋白、终浓度为０．５～２ｎｇ／ｍｌ的重组人白细胞介素－１、终浓度为５００～１０００ＩＵ／ｍｌ的重组人白细胞介素－２进行再次培养７～８天，收集ＣＩＫ细胞；ＤＣ细胞的诱导扩增及ＤＣ细胞负载腹水肿瘤抗原：将所述粘附细胞加入ＤＣ培养液中培养２～４天后加入终浓度为１５～３０μｇ／ｍｌ的所述腹水肿瘤抗原继续培养２～４天后，加入终浓度为２００～１０００ｎｇ／ｍｌ的肿瘤坏死因子，得到负载肿瘤抗原的ＤＣ细胞；ＤＣ细胞与ＣＩＫ细胞共培养制备ＤＣ－ＣＩＫ：将所述负载肿瘤抗原的ＤＣ细胞与所述ＣＩＫ细胞混合培养，得到腹水肿瘤细胞致敏ＤＣ－ＣＩＫ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘韬，
申请(专利权)人：深圳市博泰生物医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：94