特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞及其制备方法与应用。该特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞制备方法包括的步骤有：包含非受体依赖型脾酪氨酸激酶SYK基因的慢病毒的包装制备；SYK基因修饰的树突状细胞(DC)的制备；SYK基因修饰的树突状细胞诱导的特异性细胞毒性T细胞的制备。该特异性治疗方法首次以原致癌基因SYK为靶点治疗视网膜母细胞瘤，以慢病毒载体将SYK基因转染入DC细胞中，诱导制备出特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞，以激发细胞毒性T细胞特异性靶向识别并杀伤视网膜母细胞瘤，大大提高T细胞的抗肿瘤效应，且培养的特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞稳定性强，治疗效果稳定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
，具体的涉及一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细 胞毒性Τ细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB)是一种起源于视网膜核层原始细胞，儿 童眼部最常见的原发性恶性肿瘤，具有遗传和家族特性。其生长部位特殊，严重损害视力， 并且易向颅内浸润性生长，患者以婴幼儿占绝大多数，多发于5岁以下儿童，89%以上的病 人在3岁之前发病，部分患儿出生时即已发病。RB高度恶性，生长迅速，转移快，若不及时 治疗可发生眼框内、颅内及全身转移，危害患者的视力、眼球甚至生命。RB的发病率约为 1/20000, 75%病例均发生于3岁以前。目前，我国每年新增已确诊RB患者达2000人以上， 全国累计病人数上万，且有逐年增长趋势，主要是人口增加、诊断技术提高、环境改变等因 素引起。RB患儿生存期短，致残率高，死亡率高。可侵及单眼或双眼，RB单眼平均诊断年龄 为24个月，双眼为12个月，双眼发病占30%-40%。RB的致盲率占儿童致盲的6%。部分 RB患者有遗传性，约6%的病人有家族史。 RB的治疗：近年来，对单眼为Reese-Ellsworth V级肿瘤的患者行眼球摘除术、 I~IV级的患眼则采用化学减容法或局部治疗方法（包括激光光凝、经瞳孔温热疗法、冷冻 治疗和巩膜敷贴放射治疗）；对大部分双眼RB患者采用化学减容治疗，而在双眼病变程度 极不对称的患者，其高度进展的患眼仍不得不行摘除眼球，但肿瘤较小的对侧眼常可采用 局部治疗方法。绝大部分双眼RB患儿至少有1只眼曾接受化学减容法治疗。现行治疗RB 的方法虽有一定的疗效，但也具有明显的局限性。首先，眼球摘除术（尤其是30-40%的患 儿为双眼患者）不但会使患儿致盲、致残，而且对其心灵造成创伤；其次，放疗和眼球摘除 术会影响患儿面部发育，长大后要进行二次手术整容，极大地影响了生存质量，且对于晚期 巨大RB及发生转移的肿瘤，上述方法的疗效也很有限；另外，由于人体存在血脑屏障，绝大 多数抗癌药物都无法通过血脑屏障达到颅内肿瘤所在的部位，治疗效果有限，且化学治疗 会产生严重的毒副作用及其它可能出现的新问题：①新的RB肿瘤形成，随诊5年的发生率 为24% ;②抑制骨髓功能，威胁患儿生命；③肾脏和听力受损；④RB耐药性出现，目前已发 现有多种耐药蛋白不能为环孢素 A所逆转。 近年来，发达国家RB的5年生存率已达90%以上。与之相比，国内RB疗效存在 较大差距，单眼RB的5年生存率仅50%，双眼RB摘除1眼后的5年生存率为35%，大部分 RB患儿仍采取眼球摘除或眼眶内容物剜除治疗。随着对RB治疗理念的不断更新和治疗手 段的不断发展完善，目前的治疗已不单纯局限于仅以保护患儿生命为惟一目标，更重要的 是立足于提高患儿的生存质量。目前国际上对RB的治疗提倡在挽救生命的前提下，尽量保 留眼球，同时尽可能保存有用视力。 尽管当前的物理、化学治疗手段已使大部分RB患儿获得缓解，但仍有部分患儿因 为体内存在的残留肿瘤细胞而复发，且在清除和杀灭肿瘤细胞的同时不可避免地会损伤宿 主的免疫系统。鉴于RB常规治疗手段存在的一系列弊端，寻求有效的方法治疗RB成为目前 的迫切任务之一。近年来生物免疫治疗己被众多学者认可，成为具有较大潜力的治疗措施， 它能彻底清除残余的肿瘤细胞，是目前RB综合治疗的研究热点之一，有望为进一步提高RB 的生存率，改善RB患者的生存质量提供保障。 树突状细胞（dendritic cell, DC)作为人体内已知的抗原递呈能力最强的抗原 递呈细胞，成为当前肿瘤免疫治疗的热点之一。DC能摄取、加工抗原，表达高水平MHC分 子、共刺激分子、细胞粘附因子ICAM-UICAM-3以及淋巴细胞功能相关抗原-3(lymph〇Cyte function associated antigen LFA-3)等有助于抗原提呈的分子，并分泌高水平Thl型细 胞因子IL-12,有效地向T淋巴细胞提呈抗原，启动患者自身特异性杀瘤免疫反应。但大量 的实验表明肿瘤患者体内的DC处于一种"无能状态"，在体内对肿瘤抗原的呈递作用较弱。 DC与肿瘤的发生发展及预后关系密切，肿瘤的发生可能与肿瘤浸润性DC或宿主DC功能缺 陷，使其无法有效地提呈肿瘤抗原，激活T细胞识别并杀伤肿瘤细胞有关；其机制为肿瘤细 胞释放的可溶性因子作用于DC使其表面分子的表达发生变化，导致肿瘤的免疫逃逸。大多 数研究表明体内肿瘤抑制了 DC的成熟而非直接抑制DC的功能；肿瘤组织中DC的浸润程 度与肿瘤的淋巴结转移及预后有明显相关，肿瘤邻近CD1 a +DC浸润的病人其生存率明显提 高、复发率降低，Lissoni等在对40例癌症病人的临床研究中发现癌症患者外周血中成熟 和不成熟DC百分比均明显低于对照组，且有转移灶者显著低于无转移者，说明DC的缺乏在 诱发肿瘤的免疫抑制中起重要作用。 另外，不同性质的肿瘤抗原刺激DC所诱导的抗肿瘤效应强弱不等，有的甚至无 效。所以，寻找合适的肿瘤抗原负载DC尤为重要。目前主要有以下两种肿瘤抗原刺激DC 的方式： ①全细胞性肿瘤抗原致敏方式：由于目前大多数肿瘤特异性抗原类型尚未明确鉴 定，因而可对DC给予全细胞性肿瘤抗原刺激，由DC去选择肿瘤抗原并对其进行加工、呈递。 目前制备全细胞性肿瘤抗原可采用快冻慢融法、照射法、化学药物处理法、加热法等。 ②肿瘤相关抗原（Tumor Associated Antigen, TAA)基因转染方式：大多数主要组 织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC)限制性肿瘤抗原肽的半衰期 仅2-10h，若要诱导出高水平持久的抗肿瘤免疫效应，则要反复多次回输负载肿瘤抗原多肽 的DC。 有效的基因治疗依赖于外源基因的商效、稳定的表达，而利用病毒载体介导基因 转移，以其高效和良好的靶向性已成为基因治疗中应用最广泛的方法。近年来，随着病毒 基因组研究技术的迅速发展和基因的不断克隆，越来越多的病毒载体被构建并应用于以DC 为基础的肿瘤基因治疗。但是，并非所有的病毒载体都适用于DC的基因转染，主要原因是 由于转染了携带目的基因的病毒载体的DC回输后会诱导机体产生针对病毒抗原和目的基 因的免疫应答，并使得转染细胞即DC成为靶细胞而受到免疫系统的攻击；有些病毒载体可 抑制DC的抗原呈递功能，从而影响了 DC瘤苗的治疗效果；此外已存在的或新产生的抗病毒 中和抗体会干扰初次或再次免疫，从而影响机体抗肿瘤效应的诱导效果。
技术实现思路
toon] 本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种特异性治疗视网膜母细胞 瘤的细胞毒性T细胞及其制备方法。旨在解决现有肿瘤抗原刺激DC所诱导的抗肿瘤效应 不强以及不恰当选用病毒载体抑制DC的抗原呈递功能的技术问题。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下： -种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法，包括如下步骤： 将视网膜母细胞瘤原致癌基因 SYK基因片段与慢病毒表达载体连接后进行包装， 获得含有SYK基因的慢病毒SYK-LV ; 将所述SYK-LV感染树突状细胞，得到SYK基因修饰的树突状细胞； 将所述SYK基因修饰的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞的制备方法，包括如下步骤： 将视网膜母细胞瘤原致癌基因SYK基因片段与慢病毒表达载体连接后进行包装，获得含有SYK基因的慢病毒SYK‑LV； 将所述SYK‑LV感染树突状细胞，得到SYK基因修饰的树突状细胞； 将所述SYK基因修饰的树突状细胞与T细胞共同培养，得到以SYK为治疗靶点的能特异性治疗视网膜母细胞瘤的细胞毒性T细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪梅，刘韬，薛祯智，
申请(专利权)人：深圳市博泰生物医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44