本发明专利技术公开了一种重组蛋白G、其制备方法及应用。该重组蛋白G是通过改变野生型蛋白G中能与IgG结合的氨基酸序列而获得，经改变后的氨基酸序列具体如SEQIDNo.1所示；其制备方法为：构建重组蛋白G基因，并将该重组蛋白G基因连接到PET11a载体上，转化大肠杆菌，再依次经诱导表达和纯化处理，获得目标产物。本发明专利技术重组蛋白G具有能与IgGFc段特异性结合的能力，且制备方法简单，易于规模化生产，并可应用于电化学发光免疫分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术特别涉及一种特异性结合IgG Fc段的重组蛋白G、其制备方法及应用，属于生物工程
技术介绍
链球菌蛋白G( Streptococcus protein G)，是某些链球菌细胞壁中的一类能够与许多哺乳动物免疫球蛋白特异性结合的蛋白。1973年，Kronvall报道了链球菌A、C和G 群许多菌株的细胞壁及培养上清中含有能与IgG结合的蛋白质。后来，Erntell等报道链球菌C、G用的一些菌株及纯化的G蛋白除结合IgG Fc段外，亦能与F (ab) 2段结合。由于链球菌细胞壁中的蛋白G含量低，直接提取过程复杂，得率很低。通过基因与蛋白质工程技术体外重组表达，是近年来获取蛋白G的主要方法。蛋白质晶体结构显示，野生型蛋白G中存在若干个独立的IgG结合区，它可能替代全长的蛋白G直接用于抗体纯化， 并且分子量较小的单个功能区更适合克隆操作，用于进一步的结构重组及修饰，因而具有独特的优势和应用价值。由于蛋白G能特异性结合抗体的能力，因此蛋白G及其修饰衍生物得到了广泛应用和研究。比如，Jeong Min Lee等人通过基因克隆技术将蛋白G的IgG结合区末端修饰 1-3个半胱氨酸，将其固定在金表面，定向捕捉抗体，并能增强捕捉抗原的能力；Yong Taik Lim等人在蛋白G的一端修饰一段穿膜肽，另一端修饰亲和性尾巴，把功能化的纳米粒子及无任何修饰的目标抗体输送到细胞体内，进行细胞靶向、成像及线粒体的操纵；Hideki Watanabe等人克隆了一系列蛋白G的突变体，而其中有些突变体随着环境条件(pH、盐离子浓度等)的变化与抗体IgG Fc段的结合力有着明显的不同，这就为中性环境下纯化疗效性抗体提供了有力手段；P. Encinas等人重组了蛋白G不同长度的氨基酸片段与ELISA方法相结合，检测了病毒出血性的败血症病毒抗体。但迄今未见可特异性结合IgG Fc段的蛋白 G修饰衍生物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提出一种重组蛋白G，其可特异性结合IgG Fc段，从而克服了现有技术中的不足。本专利技术的另一目的在于提供前述重组蛋白G的制备方法，其通过核酸定点突变和分子克隆的技术，将蛋白G的IgG结合域的关键氨基酸位点进行了改变，消除其与IgG F(ab)2段的结合能力，从而使其获得能与IgG Fc段特异性结合的能力。本专利技术的又一目的在于提供前述重组蛋白G在电化学免疫分析中的应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用了如下技术方案一种重组蛋白G，其特征在于它是通过改变野生型蛋白G中能与IgG结合的氨基酸序列而获得，该氨基酸序列中经改变后的位点分别为第32位点的组氨酸、第36-37位点的谷氨酸和组氨酸、第40位点的组氨酸、第42位点的组氨酸、第47-48位点的脯氨酸和谷氨酸。所述重组蛋白G的氨基酸序列末端还依次连接His标签序列和活性连接臂，所述 His标签序列包括六联组氨酸，所述连接臂包括四联赖氨酸。所述重组蛋白G具有SEQ ID No. 2所示氨基酸序列。所述重组蛋白G具有SEQ ID No. 4所示基因序列。如上所述重组蛋白G的制备方法，其特征在于，该方法为构建重组蛋白G基因，并将该重组蛋白G基因连接到pETl Ia载体上，转化大肠杆菌，再依次经诱导表达和纯化处理， 获得目标产物。进一步的讲，该方法具体为构建两端引入Nhe I^PBamH I限制性内切酶位点以及终止密码子TAA的重组蛋白G基因，将该重组蛋白G基因以Nhe I和BamH I双酶切后连接到同样酶切的pETlla载体上，转化大肠杆菌获得表达菌E. coli BL21-PG，表达菌E. coli BL21-PG经培养和诱导表达后， 再经破碎和纯化处理，获得目标产物。该方法包括如下步骤(1)通过PCR克隆或人工合成重组蛋白G基因；(2)含有重组蛋白G基因的重组表达载体的构建重组蛋白G基因经NheI和BamH I 双酶切后连接到同样酶切的PETlla载体上，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子；(3)重组蛋白G的表达及纯化将得到的目的质粒转化表达菌E.coli BL21，获得的表达菌E. coli BL21-PG经IPTG诱导至少4 h后收集菌体，菌体经超声破碎、离心处理后，取上清输入金属螯合镍柱进行纯化，并取浓度100 mM 500 mM的咪唑溶液进行清洗，收集洗脱液，获得目标产物。如上所述的重组蛋白G作为电化学免疫分析试剂的应用。一种电化学免疫分析试剂，其特征在于它包括磁珠，所述磁珠表面上连接有如上所述的重组蛋白G。针对现有技术中的不足，本案专利技术人根据抗体IgG的结构特点，即抗体IgG是具有4条多肽链的对称结构，其中2条重链、2条轻链，链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的单体分子，抗体分子上两个抗原结合部位都位于两臂末端(俗称抗原结合片段，即Fab)，而抗原的柄部则是结晶片段(即Fe)，经长期研究提出了这样的假设， 即如果蛋白G能特异性结合抗体IgG的Fc段，那么抗体IgG的Fab段就能完全暴露，使其能更有效地结合抗原分子，将大大提高捕捉效率。进一步的，本案专利技术人经大量的理论研究和实践，提出了前述技术方案，即，利用分子克隆技术，基于蛋白质晶体结构模型，设计合成出蛋白G突变体基因、其体外重组表达及纯化工艺，进而获得突变体蛋白G (重组蛋白G)， 该重组蛋白可对IgG Fc段的特异性结合，并能应用于电化学发光免疫分析。附图说明图1是构建的重组表达载体pETl Ia-PG的结构示意图2是野生型及突变型蛋白G样品经金属镍亲和层析纯化的SDS-PAGE电泳图，其中左为野生型蛋白G，右为突变型蛋白G，泳道1为低分子蛋白Marker，泳道2_4是经100 mM咪唑洗镍柱3次的洗脱液，泳道5-7是经250mM咪唑洗镍柱3次的洗脱液，泳道8是经500 mM咪唑洗镍柱1次的洗脱液。图3是突变型蛋白G与羊IgG结合的变性非还原SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为大分子蛋白Marker，泳道2是羊IgG(lmg/ml)，泳道3是结合有突变型蛋白G的镍柱与羊 IgG反应产物，泳道4-5是经PBS洗镍柱的洗脱液。图4是野生型及突变型蛋白G与羊IgG的F(ab)2段结合的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为大分子蛋白Marker，泳道2为野生型蛋白G与F (ab) 2段结合产物，泳道3为突变型蛋白G与F (ab) 2段结合产物。图5是野生型及突变型蛋白G应用于电化学发光免疫分析示意图。图6是野生型及突变型蛋白G应用于免疫分析的电化学发光信号强度曲线图。具体实施例方式本专利技术通过核酸定点突变和分子克隆的技术，将野生型蛋白G的IgG结合域的关键氨基酸位点进行了改变，消除其与IgG F(ab)2段的结合能力，从而使其获得能与IgG Fc 段特异性结合的能力，获得突变型蛋白G，亦即重组蛋白G。同时，本专利技术还构建了含有该重组蛋白G基因的pET 1 Ia-PG表达质粒，获得了大肠杆菌克隆载体MC1061重组菌株，发展了利用表达菌株BL21产生重组蛋白G的方法，并将该重组蛋白质应用于电化学发光免疫分析。进一步的讲，本专利技术的技术方案如下本专利技术提供的野生型蛋白G和突变型蛋白G由68个氨基酸组成，其中包括能与抗体结合的一个基因单体结合区，其相应基因是通过全基因片段合本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种重组蛋白Ｇ，其特征在于：它是通过改变野生型蛋白Ｇ中能与ＩｇＧ结合的氨基酸序列而获得，该氨基酸序列中被改变的位点及替代的氨基酸分别为：第３２位点的组氨酸、第３６－３７位点的谷氨酸和组氨酸、第４０位点的组氨酸、第４２位点的组氨酸、第４７－４８位点的脯氨酸和谷氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾俊丽，费浩，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：32
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