本发明专利技术提供了一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白及其制备方法和应用，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明专利技术利用牛源链球菌GapC蛋白制备的亚单位疫苗对奶牛乳房炎常见的三种链球菌都具有交叉保护性，与其他疫苗相比具有更广谱的保护性，可作为奶牛乳房炎亚单位疫苗的候选抗原。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，具体地说，涉及一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
奶牛乳房炎(Bovine mastitis)是危害我国奶牛饲养业重大疾病之一。根据国内外许多学者的研究发现，链球菌属是引起乳房炎的最主要病原菌之一。目前国内乳房炎疫苗方面主要是全菌体灭活疫苗。该疫苗虽具有一定的保护力，但没有异源菌株保护力，因而对新生菌不具有免疫预防的效果。Mackie等报道使用福尔马林灭活后的无乳链球菌菌苗对奶牛无保护力。Giraudo等人采用了乳房链球菌和停乳链球菌多联灭活苗，接种疫苗并不能显著降低奶牛由链球菌引起的乳房炎的发生。奶牛中链球菌主要有五类无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌和粪链球菌，而其中以无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌为常见病原菌。近年来，研究表明链球菌表面脱氢酶位于细菌表面，具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性,与血纤维蛋白溶酶结合，在疾病发展过程和信号转导过程中起到重要作用，被认为是疫苗发展的良好靶位点。无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌GapC在DNA和氨基酸水平上有相当的同一性，这就暗示了 GapC蛋白可能作为一种抗原，用于保护奶牛对抗无乳链球菌、停乳链球菌以及乳房链球菌感染。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白；第二目的是提供奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC蛋白的制备方法；第三目的是提供一种含有奶牛乳房炎链球菌GapC蛋白的亚单位疫苗。为了实现本专利技术的第一目的，本专利技术提供了一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗 GapC蛋白，所述GapC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本专利技术还提供了编码所述GapC蛋白的相应基因，其具有SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了所述基因的表达载体及其宿主细胞。为了实现本专利技术的第二目的，本专利技术提供了奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗GapC 蛋白的制备方法，该方法包括下述步骤(1)提取牛源链球菌DNA序列；(2)根据NCBI数据库已公布序列AF375662设计引物，PCR扩增出GapC基因；(3)将回收的该基因与PMD18-T载体连接后，转化到大肠杆菌XL-I-Blue中，经酶切鉴定，筛选阳性克隆，序列测定；(4)酶切pMD18-T-GapC及pQE_30质粒，构建重组载体pQE-30-GapC，转化大肠杆菌XL-1-Blue，筛选出的阳性克隆培养后提取质粒，进行双酶切鉴定；(5)在大肠杆菌XL-I-Blue中获得高表达的上述重组工程菌，随后经镍柱纯化后得到目的蛋白，即为GapC蛋白，分子量为38kD。其中，所述重组工程菌经过发酵培养进行优化，其发酵培养的条件为37°C、pH值 7.0、装液量20%、种龄12-1^1、转数180-220rpm，而接种量为1% -3%0其中，扩增GapC基因所用的引物如下所示5' -CGC IGGATCCI ATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3‘5' -GAC |GTCGAC[ AGCGATTTTTGCAAAATACTC-3‘。其中，所述PCR 反应条件为95°C预变性 15min，94°C 45s, 56°C 45s, 72°C 2min， 30 个循环，72°C IOmin。其中，所述牛源链球菌为停乳链球菌(S. dysgalactiae)。本专利技术还提供了含有上述GapC蛋白的亚单位疫苗，该疫苗由GapC蛋白溶液与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂按1 1混合混合乳化制成，其中GapC蛋白溶液的浓度为 3. 3mg/ml-4mg/ml0本专利技术还提供了上述GapC蛋白，制备所述GapC蛋白的方法在制备预防奶牛乳房炎亚单位疫苗中的应用。本专利技术利用牛源链球菌GapC蛋白制备的亚单位疫苗对奶牛乳房炎常见的三种链球菌都具有交叉保护性，与其他疫苗相比具有更广谱的保护性，可作为奶牛乳房炎亚单位疫苗的候选抗原。附图说明图1为本专利技术所述PCR扩增得到的GapC基因片段大小为1005bp ；图2为本专利技术所述重组质粒pQE-30-GapC经BamHI和Ml I双酶切，获得预期大小的两个目的基因片段CMOObp和1005bp)；图3为本专利技术所述诱导菌在约38kD处表达的蛋白条带，与重组融合蛋白大小相一致；图4为本专利技术所述小鼠ELISA检测各周免疫血清效价；图5为本专利技术所述奶牛ELISA检测各周免疫血清效价。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。TR-GapC蛋白为停乳链球菌GapC蛋白、WR-GapC蛋白为无乳链球菌GapC蛋白、RF-GapC蛋白为乳房链球菌GapC蛋白。实施例1基因工程重组菌pQE-30-GapC/XL-l-Blue的构建以及牛源链球菌GapC 蛋白亚单位疫苗的制备(1)牛源停乳链球菌亚单位疫苗GapC基因的制备。DNA的提取取1. 5mL停乳链球菌培养物，如LS0312株，IOOOOrpm离心^iiin ；沉淀物加入 567 μ L TE,反复吹打。之后加 30 μ 1 10% SDS 和 3 μ 1 20mg/mL 的 Proteinase K,混勻，37°C水浴Ih ；加100 μ 1 5Μ NaCl，混勻，再加入80 μ 1 CTAB/NaCl，混勻。65°C水浴 IOmin ；加入等体积的氯仿/异戊醇，混勻，12000rpm离心4-5min，上清液转入一新管；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混勻，12000rpm离心5min，上清液转移至一新管；加入0. 6体积的异丙醇，轻混，沉淀DNA 30min，12000rpm离心15min，弃上清；加入ImL 70%乙醇洗涤 DNA ； 12000rpm离心5min，弃上清，干燥，溶于50 μ L TE中。根据停乳链球菌GapC的DNA序列，设计上下游引物及限制性酶切位点，其中在上游加入BamHI酶切位点，下游加入Ml I酶切位点Pl 5' -CGCGGATCCATGGTAGTTAAAGTTGGTATT-3'Ρ2 5' -GACGTCGACAGCGATTTTTGCAAAATACTC-3'反应条件为95°C预变性15min，94°C预变性45s，56°C退火45s，72°C延伸2min， 30个循环，72°C延伸lOmin，得到GapC基因。将回收的GapC基因与pMD18_T连接，转化大肠杆菌XL-1-Blue。利用BamHI和Ml I进行双酶切鉴定，筛选阳性的克隆，测序鉴定。测序正确后对pMD 18-T-GapC及pQE-30质粒用BamHI和Ml I进行双酶切，构建重组载体 pQE-30-GapC，转化大肠杆菌XL-1-Blue。筛选出的阳性克隆培养后提取质粒，进行双酶切鉴定。实验结果表明扩增到了预期大小即约1005bp的目的片段，参见图1。重组质粒 pQE-30-GapC经BamHI和Mil 37°C双酶切，获得预期大小的两个目的基因片段CMOObp 和1005bp)，参见图2。DNA序列经测定，插入的GapC基因的序列正确，结果表明重组 pQE-30-GapC构建完全正确。(2)牛源无乳链球菌和乳房链球菌亚单位疫苗G本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种奶牛乳房炎链球菌亚单位疫苗ＧａｐＣ蛋白，其特征在于，所述ＧａｐＣ蛋白的氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱战波，崔玉东，车车，张军，于立权，周玉龙，柳强，朱洪伟，王鹤，杨玉英，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：23
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