本发明专利技术公开了一种鸭瘟病毒检测用引物组及其构成的LAMP反应体系。该检测用引物组包括正向外侧引物F3：SEQ?ID?NO:1、反向外侧引物B3：SEQ?ID?NO:2、正向内侧引物FIP：SEQ?ID?NO:3和反向内侧引物BIP：SEQ?ID?NO:4。由前述引物组成的LAMP反应体系，还包括反应缓冲液，dNTPs，Mg2+，甜菜碱，BstDNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水等。该反应体系操作方法简单，特异性和灵敏度高，检测结果鉴定简便，在小型研究所、兽医站乃至普通养殖户有着更广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鸭瘟病毒检测用引物组及其构成的LAMP反应体系。
技术介绍
鸭瘟(Duck Plague，DP)，又名鸭病毒性肠炎，是由鸭肠炎病毒(Duck Enteritis virus, DEV)引起的鸭、鹅、天鹅等雁形目禽类的一种急性败血性及高度致死性的病毒性传染病。鸭瘟病毒属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科，球形有囊膜，直径约为160 180 nm，衣壳为二十面体对称，是一种泛嗜性感染的病毒(Kaleta，1990)。该病毒主要由核心(core)、 衣壳(capsid)、外膜(tegument)、囊膜(envelope)四部分组成，病毒核酸为线状、双股DNA。 衣壳的形态结构具有疱疹病毒的重要特征，它由162个相互连接呈放射状排列且有中空轴孔的壳粒组成。核衣壳穿过宿主细胞核膜进入胞浆或其空泡中，外面包上一层由蛋白质组成的外膜，最后绕以囊膜形成成熟的子病毒(陈建君，2003)。病毒的囊膜表面无红细胞凝集素，不具血凝特性和血细胞吸附作用。鸭瘟病毒对热敏感，56 °C作用10 min会丧失感染力， 80 °C作用5 min即可死亡。此外，该病毒对乙醚和氯仿敏感。用胰蛋白酶和脂肪酶等处理能使病毒部分失活或者完全失活，在PH值为3的酸性和pH值为11的碱性环境中也很快失活。鸭瘟分布广泛，具有传播迅速、发病率高和死亡率大的特点。1923年Baudet首次报道荷兰的家鸭暴发鸭瘟后，各养鸭国家和地区陆续报导有该病的发生和流行。我国于 1957年首次报道暴发鸭瘟，随后该病在华南、华中和华东等养鸭较多的地区开始流行，是严重威胁养鸭业发展的重要传染病之一。鸭瘟潜伏期约2 5d，临诊特征为病初体温升高，两脚发软无力，绿色下痢，流泪； 食道黏膜有小出血点，并有灰黄色假膜覆盖或溃疡，泄殖腔黏膜充血、出血、水肿和坏死；肝脏有大小不等的坏死灶及出血点；部分病鸭可见头颈部粗肿，俗称“大头瘟”。病鸭后期体温下降，衰竭死亡，死亡率可达90%以上，少数耐过的病鸭表现为生长不良和消瘦，眼角膜混浊或形成角膜溃疡而失明(王春雨，2008 )。病毒可在9 14 d鸭胚中生长繁殖，并可引起胚胎死亡。致死的胚体出血，水肿，肝出血、坏死，部分绒毛尿囊膜上有灰白色坏死灶。病毒适应鸭胚后也可感染鸡胚，可在鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞中增殖传代，产生蚀斑并形成核内包涵体(董嘉文等， 2009)。快速准确地诊断病原是控制鸭瘟流行的前提。鸭瘟病毒只有一种血清型，虽然各毒株之间的毒力存在差异，但在免疫学特性上都高度近似(董嘉文等，2009 )。适用于鸭瘟病毒常规的血清学诊断方法主要有病毒分离与中和试验、酶联免疫吸附测定、间接血凝试验等方法，但这些检测技术都不同程度地存在实验周期长、实验操作复杂、敏感性低、检出率不高等缺陷，加之鸭瘟感染病程发展迅速，急需建立更加快速、特异和敏感的检测方法
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种鸭瘟病毒检测用引物组。本专利技术的另一目的是提供由上述引物组构成的环介导等温扩增(LAMP)反应体系。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的 一种鸭瘟病毒检测用引物组，具体组成如下 正向外侧引物F3 =SEQ ID N0:1 ；反向外侧引物B3 =SEQ ID NO:2 ； 正向内侧引物FIP :SEQ ID NO:3 ； 反向内侧引物BIP :SEQ ID N0:4。本专利技术所述鸭瘟病毒，是指鸭肠炎病毒(Duck Enteritis virus，DEV)。以上引物组是通过Blast、MegAlign和DNAMar程序筛选出的DEV UL6蛋白基因的保守序列(GenBank: AY995224. 1, 2198-2435)作为模板，用 Primer Explorer V4 软件设计所得。该引物组包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，内引物FIP由Flc (TCCAGAGGATGGTTTGTCCCGT,SEQ ID N0:5)禾口 F2 (ATGTATCATGGACGGCGGT,SEQ ID NO:6)组成，为利于后续扩增产物的酶切鉴定，BIP由Blc(CAGCGAGTGGGAACGAAAAGC，SEQ ID NO: 7)、 B2 (TCGCACATTAGACGCGGTATC, SEQ ID NO 8)禾口 GAATTC (.EcoR I 酶切位点序列)作为连接子组成。鸭瘟病毒的引物设计比较复杂，且对引物扩增区的要求较高。所以引物设计没有普通引物设计简单，要设计出优良的引物，需要在各种生物信息软件评估的基础上进行费时的筛选。由于所设计的引物具有高度的选择特异性，在进行病原检测时，要求引物所针对的靶序列位点应该相当保守，这样所建立的方法才具有适用性。研究中也可以设计一些兼并引物以增强其应用的广泛性，但兼并度高的引物会对扩增反应造成负面影响。靶序列长度应控制在200 bp左右，才有利于扩增反应的进行，过长会给反应起始物的形成与后期循环反应带来困难，有时甚至在1 h内没有明显扩增。对于一些具有GC含量高、变异性强、保守区离散等特点的目的序列，没有办法设计出非常适用的引物，使LAMP技术的应用受到限制。由于LAMP产物的独特性给线性双链DNA的分离增加了难度，更加有效的分离方法有待于进一步的研究。产物电泳图为梯状拖带图样，一旦出现非特异性扩增就不易被察觉， 所以用限制性内切酶进行鉴定就显得十分必要。该技术非常适用于鉴定某种基因的存在， 但扩增产物对于基因克隆与测序意义不大。因此，在分子生物学领域，LAMP技术在疾病诊断、性别鉴定与食品安全有着比常规PCR技术更出色的表现，但在很多方面，如基因序列确定、文库建立，是无法取代传统PCR技术的。一种检测鸭瘟病毒的LAMP反应体系，其特征在于该反应体系包括反应缓冲液 (200 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 100 mM (NH4)2SO4, 1% Triton X-100)， dNTPs (包括等比例的 dATPs、dTTPs、dGTPs 和 dCTPs)，上述引物组(F3、B3、FIP 和 BIP)，Mg2+ (一般用MgSO4),甜菜碱(Betaine)，Bst DNA聚合酶，待检样品基因组DNA和去离子水。Mg2+稳定碱基配对，维持聚合酶的反应活性都有重要作用，它对LAMP的影响方式与PCR的相同，浓度太高或太低都使反应无法进行或时间延长同时反应过程中焦磷酸镁沉淀的析出使反应体系中Mg2+的浓度不断下降，因此摸索Mg2+最佳浓度很有意义。经过多次试验筛选，LAMP反应体系中Mg2+浓度优选4 7 mM，最佳为5 mM。甜菜碱浓度最佳为0. 4 M0 dNTPs 浓度为 1. 2 mM(即 dATPs、dTTPs、dGTPs 和 dCTPs 的浓度均为1. 2 mM)。作为一种优选方案，本专利技术的LAMP反应体系为每25PL中含有以下组分 IO反应缓冲液2.5 pLdNTPs (10 mM)3 μ FIP (10 μΜ)2“LBP (10 μΜ)2 μ F3 (10 μΜ)0.5 pLΒ3 (10 μΜ)0.5 pL。MgSO4 (25 mM)3 μ 甜菜碱(0.4 Μ)2.5 μ!Bst DNA 聚合贿1 μΙ-本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种鸭瘟病毒检测用引物组，其特征在于，所述引物组组分如下：正向外侧引物Ｆ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１；反向外侧引物Ｂ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２；正向内侧引物ＦＩＰ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３；反向内侧引物ＢＩＰ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢青梅，冀君，邹禄生，孙宝丽，马静云，毕英佐，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81
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